16S 扩增子分析：QIIME 2 与 DADA2
16S rRNA 扩增子测序先用 PCR 扩增细菌和古菌 16S rRNA 基因的一个或几个高变区（如 V4、V3-V4），再进行高通量测序，以较低成本描述样本中有哪些微生物以及它们的相对丰度。分析的核心是把原始读段转成特征表：切除引物、质量过滤、去噪得到扩增子序列变体（ASV）、去除嵌合体，再与 SILVA、Greengenes2 等数据库比对完成物种注释，并构建系统发育树。QIIME 2 是常用的整合平台，DADA2 是最常用的去噪算法之一。真菌通常测 ITS 区，流程类似，但要针对 ITS 长度可变的特点调整。得到的特征表是后续多样性分析、差异丰度分析和功能预测的起点。
什么时候用
- 描述粪便、口腔、皮肤、土壤等样本的细菌群落组成
- 在大样本队列中低成本比较不同组的菌群结构
- 研究抗生素、饮食或药物干预前后的菌群变化
- 用 ITS 扩增子研究真菌群落组成
- 只有 16S 数据时，初步推测群落的功能潜力
不适合的情况
- 需要准确到种或菌株：短高变区的分辨率通常只到属
- 需要实测功能基因、耐药基因含量：应做宏基因组测序
- 宿主 DNA 占绝大多数的低生物量样本且没有阴性对照
需要准备的数据
- 双端 FASTQ
- 每个样本一对文件，需知道扩增区域、正反向引物序列和测序读长（如 2×250 或 2×300）。
- 样本元数据表
- 第一列为样本 ID，包含分组、采样时间、DNA 提取批次和测序批次，表头按 QIIME 2 要求填写。
- 参考数据库
- 16S 常用 SILVA 或 Greengenes2，ITS 常用 UNITE；最好使用按扩增区域训练的分类器。
- 对照样本
- 阴性提取对照、PCR 空白和模拟群落（mock community），用于识别污染和评估流程准确性。
分析步骤
- 1
导入与质量概览
按 manifest 文件导入 FASTQ，混合文库先按条形码拆分。用 demux summarize 查看每个样本的读段数和各位置的质量分布，作为设定截断长度的依据。
- 2
切除引物
用 cutadapt 切除正反向引物，同时丢弃找不到引物的读段。保留比例异常低通常说明引物序列、方向或简并碱基写错，需要先排查再继续。
- 3
DADA2 去噪
根据质量图设定截断长度和左端修剪长度，学习错误模型后去噪、合并双端并去除嵌合体。查看每一步保留的读段比例，合并后大幅下降通常是重叠不足。
- 4
物种注释
用与扩增区域匹配的朴素贝叶斯分类器注释，得到门到属的分类。用 mock community 检查注释出的属与已知组成是否一致，偏差大时考虑更换分类器。
- 5
过滤与去污染
去除线粒体、叶绿体和未注释到细菌界的序列，用 decontam 等方法依据阴性对照识别污染 ASV，再过滤只在极少数样本出现的低丰度特征。
- 6
构建系统发育树
用 MAFFT 比对代表序列，再用 FastTree 建树，供 Faith PD 和 UniFrac 距离计算使用。树中出现极长枝的 ASV 可能是非目标扩增产物，应回查其注释。
- 7
功能预测
需要时用 PICRUSt2 根据 ASV 序列推断 KO、EC 和 MetaCyc 通路丰度，并检查 NSTI 值。NSTI 高表示该 ASV 与已测序参考基因组相距较远，预测可信度低。
关键参数与决策
截断长度（trunc-len）
在质量开始明显下降处截断，但双端截断后仍需足够重叠，DADA2 合并默认要求至少 12 bp。V3-V4 等较长扩增子截得太短，会导致大量读段无法合并。
最大期望错误（maxEE）
读段期望错误数超过阈值即丢弃，默认值较严格。质量较差的反向读段可以适当放宽，但放得过宽会引入更多伪 ASV。
去噪方法
DADA2 适合双端数据并内置嵌合体去除；Deblur 按固定长度修剪，常用于单端数据。同一项目所有批次必须使用同一方法和参数，ASV 才能直接合并。
分类器训练
通用的全长预训练分类器可以直接使用，但按扩增区域截取参考序列重新训练的分类器通常更准确。数据库名称和版本需在方法中写明。
污染识别阈值
decontam 的 prevalence 方法比较特征在阴性对照与真实样本中的出现频率，阈值越高去除越激进。低生物量样本污染比例高，需更严格的阈值。
常见错误
- 不切除引物就去噪：引物中的简并碱基会被当作真实序列差异，产生大量伪 ASV，嵌合体比例也会升高。
- 不同测序批次分别跑 DADA2 且截断长度不同：同一真实序列会因长度不同变成不同 ASV，合并后看起来像批次间组成差异。
- ITS 数据也按固定长度截断：ITS 长度变化大，固定截断会系统性丢掉片段较长的类群，造成真菌组成偏倚。
- 把相对丰度当成绝对菌量：不同细菌的 16S 拷贝数差异较大，相对丰度升高也可能只是其他菌减少。
- 低生物量样本不设阴性对照：试剂和环境带入的污染菌可能占相当比例，无法区分真实信号和污染。
- 把 PICRUSt2 结果当作实测功能：预测依赖参考基因组推断，只能作为假设，需要宏基因组等数据验证。
结果怎么看
读段追踪表
记录每个样本在过滤、去噪、合并、去嵌合体各步保留的读段数。合并这一步损失过半，通常是截断过短导致重叠不足；嵌合体比例异常高，提示 PCR 循环数过多。
物种组成堆叠图
展示门或属水平的相对丰度，重点看组间优势类群的差异。如果阴性对照的组成与真实样本相似，说明样本生物量不足，相应样本的结果需要谨慎解读。
稀释曲线
横轴为抽样深度，纵轴为观察到的 ASV 数。曲线趋于平台说明测序深度足够；仍在上升的样本丰富度被低估，可据此选择抽平深度或剔除深度过低的样本。
ASV 特征表与注释表
每行一个 ASV，列为各样本计数，并附分类信息。大量 ASV 只注释到界或门，可能是分类器与扩增区域不匹配，或存在宿主线粒体等非目标扩增。
功能预测表
PICRUSt2 输出的 KO 或通路丰度以及加权 NSTI。加权 NSTI 偏高的样本预测可信度低；组间显著的通路建议在宏基因组数据中验证后再作为结论。
和相近方法怎么选
DADA2 ASV 与 97% OTU 聚类
OTU 按序列相似度聚类，会合并近缘类群，结果依赖当前数据集；ASV 是去噪后的精确序列，可以跨研究直接比较，分辨率更高。新项目通常采用 ASV，复用旧 OTU 数据时需统一口径后再比较。
QIIME 2 与 R 中的 dada2 流程
QIIME 2 以插件封装各步并自动记录数据来源，适合标准化流程和团队协作；R 中直接使用 dada2 包配合 phyloseq，更便于定制参数和后续统计建模。两者的核心去噪算法相同，可按团队习惯选择。
16S 扩增子与宏基因组测序
16S 成本低，适合大样本描述群落组成，但分辨率多到属，功能只能预测；宏基因组可到种和菌株，并直接得到功能基因，但测序和计算成本更高。常见策略是先用 16S 筛查，再对关键样本做宏基因组。
常见问题
16S 测 V4 区还是 V3-V4 区？
两者都常用。V4 片段较短，2×250 测序就能充分重叠，错误率低；V3-V4 信息量更大，但需要 2×300 测序，且反向读段尾部质量常较差。选择时主要考虑与已有数据的可比性和目标类群的分辨率。
DADA2 截断长度怎么设？
先看质量图，在中位质量明显下降处截断。同时计算去除引物后的扩增子长度，正反向截断长度之和应至少比它多 12 bp，最好再留一些余量容纳长度变异。可以试几组参数，选合并后保留读段最多的一组。
ASV 表要不要抽平？
做 α 和 β 多样性时常抽平到统一深度，减少测序深度差异的影响；做差异丰度分析时通常不抽平，而是使用方法自带的标准化。抽平深度一般参考稀释曲线和样本深度分布，并剔除深度过低的样本。
物种注释用 SILVA 还是 Greengenes2？
SILVA 覆盖面广、更新较勤，是常用选择；Greengenes2 与全基因组系统发育统一，便于和宏基因组数据整合。同一项目只用一个数据库，并在方法中写明版本，跨研究比较时也要注意数据库是否一致。
PICRUSt2 的结果可信吗？
可以作为功能潜力的参考，但不是测量值。准确度取决于样本中的细菌与已测序参考基因组的接近程度，人体肠道样本通常较好，土壤等环境样本较差。关键结论应以宏基因组或宏转录组数据验证。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供 FASTQ、扩增区域、引物序列和样本信息后，会先确认去噪方法、截断参数和参考数据库，再进行 16S 与 ITS 扩增子分析，完成引物切除、去噪、嵌合体去除、物种注释和系统发育树构建；需要时进行扩增子功能组成预测。交付读段追踪表、ASV 特征表、物种组成图、稀释曲线、功能预测表、分析报告和可复现脚本。
我有 60 个粪便样本的 V3-V4 区 16S 双端测序数据和分组表，想用 QIIME 2 和 DADA2 得到 ASV 表和属水平组成，并预测功能。