微生物 α 多样性与 β 多样性分析
多样性分析通常是微生物组研究最先报告的结果。α 多样性描述单个样本内部的多样程度，包括丰富度（有多少种）和均匀度（各物种是否均衡），常用 observed features、Chao1、Shannon、Simpson 以及考虑系统发育关系的 Faith PD。β 多样性描述样本之间群落组成的差异：先计算 Bray-Curtis、Jaccard、UniFrac 或 Aitchison 距离，再用 PCoA 或 NMDS 降维可视化，用 PERMANOVA 检验分组能解释多少组成差异。输入通常是 16S 或宏基因组的特征表，配合系统发育树和样本元数据。多样性回答「两组菌群整体是否不同」，具体哪些菌不同则交给差异丰度分析。
什么时候用
- 比较疾病组与健康组菌群的丰富度和均匀度
- 检验干预、饮食或地理来源能否解释群落组成差异
- 纵向研究中观察同一个体菌群随时间的稳定和恢复
- 评估 pH、温度或临床指标等环境因子与群落结构的关联
- 检查测序批次、提取方法等技术因素对组成的影响
不适合的情况
- 想知道具体是哪些菌在组间不同，应做差异丰度分析
- 样本测序深度差异极大，却不做任何深度处理就比较丰富度
- 每组只有两三个样本，却期望 PERMANOVA 给出可靠结论
需要准备的数据
- 特征表
- ASV、OTU 或物种丰度表；α 指数和多数距离需原始计数，只有相对丰度时可用的指数有限。
- 系统发育树
- 计算 Faith PD 和 UniFrac 距离必需，树上的序列名称需与特征表完全一致。
- 样本元数据
- 分组、个体 ID、时间点、批次和连续协变量；重复测量设计必须有个体标识。
- 环境或临床变量（可选）
- 用于 Mantel 检验、db-RDA 或 envfit，连续变量注意量纲差异并检查缺失值。
分析步骤
- 1
确定深度处理
根据稀释曲线选择抽平深度，剔除低于该深度的样本；或采用不需要抽平的方法，如基于 CLR 转换的 Aitchison 距离。记录被剔除的样本及其分组，避免某组样本被大量剔除。
- 2
计算 α 多样性
同时计算偏重丰富度的指数（observed features、Chao1）和兼顾均匀度的指数（Shannon、Simpson），有系统发育树时加算 Faith PD。不同指数结论不一致时要分别解释。
- 3
α 多样性检验
两组用 Wilcoxon 秩和检验，多组用 Kruskal-Wallis 加事后两两比较并做多重校正。有协变量或重复测量时改用线性混合模型，把个体作为随机效应。
- 4
计算 β 距离
按研究问题选择距离：Jaccard 和非加权 UniFrac 关注物种有无，Bray-Curtis 和加权 UniFrac 关注丰度，Aitchison 距离针对组成性数据。预先指定一个主要距离。
- 5
排序可视化
对距离矩阵做 PCoA，在坐标轴上标注前两轴的解释方差；用 NMDS 时需报告 stress 值。按分组着色并添加置信椭圆，直观判断组间是否分离。
- 6
PERMANOVA 检验
用 vegan 包的 adonis2 检验分组效应，报告 R²、F 和 P 值，置换常用 999 次。有多个变量时按边际效应检验，并纳入年龄、批次等协变量。
- 7
离散度检验
用 betadisper 检验各组样本到组中心的距离是否一致。PERMANOVA 显著而离散度也显著不同时，组间差异可能部分来自组内变异大小不同，而非中心位置不同。
关键参数与决策
抽平深度
通常选在多数样本稀释曲线进入平台、同时保留大部分样本的位置。设得太高会丢样本，太低会低估丰富度；是否抽平存在争议，可以用不抽平的方法做敏感性分析。
距离度量
不同距离回答不同问题：稀有类群有无的变化在非加权 UniFrac 中更明显，优势菌比例变化在 Bray-Curtis 中更明显。事先指定主要距离，避免逐个尝试后挑显著的报告。
PERMANOVA 检验方式
adonis2 默认按变量顺序逐项检验，先放入的变量会占用共享的变异。有多个变量时设置 by = "margin"，得到每个变量在调整其他变量后的边际效应。
置换限制
配对或重复测量设计中样本不独立，应把置换限制在个体内部，可用 permute 包设置区组。不加限制时 P 值会偏小，夸大组间差异。
置换次数
999 次置换能得到的最小 P 值约为 0.001，常用于主分析；需要更精细的 P 值、要对多个距离或多个变量做多重校正时，可增加到 9999 次，代价是计算时间变长。
常见错误
- 对 DADA2 输出计算 Chao1：DADA2 去噪会去掉单例序列，而 Chao1 依赖单例数估计未观测物种，结果失去意义。
- 只放 PCoA 图而不做统计检验：图上是否分开受坐标轴选择和点数影响，必须有 PERMANOVA 等置换检验支持。
- PERMANOVA 显著就断言组成不同：若 betadisper 也显著，差异可能只来自组内离散度不同，需要同时报告两者。
- 同一研究里有的样本用计数、有的用相对丰度算指数：输入不同会使指数尺度不一致，比较前需统一输入格式。
- 测序批次与分组完全重合：β 多样性差异无法区分是生物学差异还是批次效应，应在实验设计阶段打散批次。
结果怎么看
α 多样性箱线图
每组一个箱体并标注检验 P 值。Shannon 下降而丰富度不变，说明少数菌占优、均匀度下降；某组方差特别大时，先检查是否混入了深度过低的样本。
PCoA 散点图
每个点代表一个样本，坐标轴标注解释方差。同组聚集、组间分离说明组成差异明显；若前两轴解释方差都很小，图上的分离只代表了总变异中的一小部分。
PERMANOVA 结果表
列出每个变量的 R²、F 和 P 值。R² 是该变量解释的组成变异比例，微生物组研究中单个因素的 R² 通常不高；P 显著但 R² 很小时，应如实描述为效应有限。
离散度检验图
展示各组样本到组中心的距离分布。某组离散度明显更大，说明组内个体差异大，常见于疾病或抗生素处理后的菌群失调状态，此时 PERMANOVA 结果需结合解读。
环境因子约束排序图
db-RDA 或 envfit 在排序图上以箭头表示环境或临床变量，箭头越长、与样本分布方向越一致，说明该变量与群落变化关联越强。只看显著变量，并检查变量之间是否高度共线，共线变量的箭头不能分别解读。
和相近方法怎么选
PCoA 与 NMDS
PCoA 基于特征分解，坐标轴有可报告的解释方差，结果唯一；NMDS 只保留样本间距离的排序关系，对非线性结构更稳健，但需要报告 stress，多次运行结果可能略有差异。常用 PCoA 作主图，NMDS 作补充。
PERMANOVA 与 ANOSIM
两者都是基于距离矩阵的置换检验。PERMANOVA 可以纳入多个变量和协变量并给出 R²；ANOSIM 只能比较单一分组，且对组间离散度差异更敏感。多因素设计建议使用 PERMANOVA。
多样性分析与差异丰度分析
多样性分析把整个群落压缩为一个指数或一个距离，回答群落整体是否不同；差异丰度分析逐个检验类群，回答哪些菌不同。通常先用多样性确认整体差异，再用差异丰度定位具体类群。
常见问题
Shannon 指数和 Simpson 指数有什么区别？
两者都同时反映丰富度和均匀度。Shannon 对稀有物种更敏感，Simpson 更受优势物种影响，常以 1 减 D 或其倒数形式报告。不同软件默认的对数底数和 Simpson 形式可能不同，报告时应注明。
PERMANOVA 的 R² 多大才有意义？
没有统一标准。微生物组受个体差异影响很大，单个分组变量只解释几个百分点的组成变异也很常见。应结合 P 值、离散度检验和生物学背景解释，不要只凭 P 值下结论。
多样性分析一定要抽平吗？
不一定。抽平是让 α 多样性在相同抽样深度下可比的常用做法，但会丢弃数据。替代方案包括用稀释与外推方法比较丰富度，或用基于 CLR 的 Aitchison 距离做 β 多样性。两种方案结论一致时更有说服力。
NMDS 的 stress 多少可以接受？
经验上 stress 小于 0.1 表示排序较好，小于 0.2 尚可接受；大于 0.2 时二维图难以代表样本间真实的距离关系，可以增加到三维或改用 PCoA。stress 值应标注在图中，并说明使用的距离和随机起始次数。
配对样本的 β 多样性怎么检验？
把个体 ID 作为区组，限定置换只在个体内部进行，或在模型中纳入个体项。也可以计算每个个体前后两次样本之间的距离，再在组间比较这些距离，回答「哪一组变化更大」。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供特征表、系统发育树和样本信息后，会先确认抽平策略、距离度量和检验设计，再进行微生物群落多样性分析：计算 α 多样性指数并做组间检验，计算 β 距离并完成 PCoA 或 NMDS 排序、PERMANOVA 和离散度检验。交付 α 多样性箱线图、排序图、PERMANOVA 结果表、统计报告和可复现脚本。
我有 QIIME 2 导出的 ASV 表、进化树和元数据，想比较三组小鼠的 Shannon 指数，并做 Bray-Curtis PCoA 与 PERMANOVA。