TCR/BCR 免疫组库分析
免疫组库分析研究 T 细胞受体（TCR）和 B 细胞受体（BCR）序列的组成。每个 T 或 B 细胞克隆经过 V(D)J 重排后带有独特的 CDR3 序列，统计这些序列就能知道组库有多丰富、是否有少数克隆显著扩增、哪些克隆在治疗前后出现或消失。常见数据包括靶向扩增 TRB、IGH 等链的 bulk 组库测序、10x Genomics 等平台的单细胞 V(D)J 测序，也可以用 TRUST4、MiXCR 从普通 RNA-seq 中提取受体序列。分析通常包括克隆型定义、V/J 基因使用、多样性与克隆性、样本间重叠和克隆追踪，BCR 还会关注体细胞高频突变和同种型转换。
什么时候用
- 比较治疗前后、应答与非应答患者的 T 细胞克隆扩增程度
- 追踪肿瘤、外周血和淋巴结之间共享的克隆型
- 疫苗接种或感染后观察 B 细胞克隆的扩增与体细胞突变
- 在单细胞数据中把克隆型与细胞亚群、耗竭状态联系起来
- 评估自身免疫病中的寡克隆扩增和公共克隆型
不适合的情况
- 仅凭 CDR3 序列断定抗原特异性，需数据库匹配或功能实验支持
- 测序深度或细胞数差异很大的样本直接比较多样性指数
- 用普通 3' 单细胞转录组数据重建配对 α/β 链，捕获率通常很低
需要准备的数据
- bulk 组库 FASTQ
- 注明扩增的链（TRB、IGH 等）、是否带 UMI，以及建库方式（如 5' RACE 或多重 PCR）。
- 克隆型表
- MiXCR、Cell Ranger 等导出的结果，需含 CDR3 氨基酸序列、V/J 基因和计数或频率。
- 单细胞 V(D)J 结果
- 如 10x 的 filtered_contig_annotations，细胞条形码需与基因表达数据一致。
- 样本信息
- 患者、时间点、组织来源和分组；克隆追踪必须明确同一患者各样本的对应关系。
分析步骤
- 1
比对与组装
用 MiXCR、IgBLAST 或 TRUST4 把读段比对到 IMGT 参考的 V、D、J 基因并组装 CDR3。查看比对率和成功组装比例，比对率极低多提示链类型或物种参数设错。
- 2
UMI 去重纠错
带 UMI 的数据按分子而不是按读段计数，可以消除 PCR 扩增偏差和测序错误产生的假克隆。去重后大量只有一两条读段的克隆消失，属于正常现象。
- 3
定义克隆型
TCR 常用 CDR3 氨基酸序列加 V 基因定义克隆型；BCR 存在体细胞突变，通常在 V、J 基因和 CDR3 长度相同的序列中，按 CDR3 核苷酸相似度聚成克隆群。
- 4
基因使用分析
统计 V、J 基因及 V-J 配对频率，比较组间是否存在偏好性使用，以热图或柱状图展示。计算频率时按样本总克隆数或总分子数归一化，避免深度影响。
- 5
多样性与克隆性
在相同抽样深度下计算 Shannon、Simpson、Chao1、克隆性和 Gini 系数，并绘制稀释曲线确认是否接近饱和。曲线仍在快速上升的样本，丰富度会被明显低估。
- 6
重叠与追踪
计算样本间 Jaccard 或 Morisita-Horn 重叠指数，追踪同一患者不同时间点中高频克隆的频率变化，识别治疗后新出现并扩增的克隆。
- 7
特异性与表型
将 CDR3 与 VDJdb、McPAS-TCR 等数据库比对，或用 GLIPH2、TCRdist 聚类相似序列；单细胞数据可把扩增克隆映射到 UMAP 上，查看所属亚群。
关键参数与决策
抽样深度归一化
多样性指数强烈依赖读段数或细胞数。比较前通常把各样本下采样到相同的克隆计数或细胞数，或使用基于 Hill 数的稀释与外推曲线，避免把深度差异当成生物学差异。
克隆型定义口径
核苷酸口径会把编码相同氨基酸的克隆分开，氨基酸口径更接近抗原识别单位。是否纳入 V 基因、是否要求 α/β 配对，都会改变克隆数和重叠结果，全文需保持一致。
BCR 克隆聚类阈值
常按 CDR3 核苷酸距离聚类，阈值可参考 SHazaM 计算的最近邻距离分布。阈值过松会把不同克隆合并，过严会把同一克隆的突变后代拆开。
扩增克隆判定
单细胞数据中常把出现在两个及以上细胞的克隆型视为扩增克隆，bulk 数据可用频率排名或频率阈值。阈值需结合总细胞数设定，并在方法中写明。
链的选择
TCR 研究常以 TRB 为主，β 链多样性高、定义克隆更稳定；BCR 以 IGH 为主，还能获得同种型信息。单细胞配对数据可同时使用两条链提高定义精度。
常见错误
- 直接比较深度不同样本的 Chao1 或丰富度：读段多的样本自然检出更多稀有克隆，差异可能完全来自测序量。
- 没有 UMI 也不做纠错：高频克隆的 PCR 和测序错误拷贝会被当作大量低频新克隆，虚增多样性和丰富度。
- 把公共克隆型当作抗原特异性证据：部分公共克隆源于生成概率高的序列，多人共享不等于识别同一抗原。
- 混用不同建库体系的数据做克隆追踪：DNA 与 RNA 来源、不同引物体系对克隆频率的估计不同，跨批次比较会有系统偏差。
- 单细胞中只检出一条链的细胞也按完整克隆型统计：容易把不同克隆合并，配对分析应限定在双链都检出的细胞。
结果怎么看
克隆频率分布图
展示高频克隆占总组库的比例。少数克隆占比很高说明存在寡克隆扩增；健康外周血中单一克隆占比通常较低，若前十个克隆占据大部分序列，需排除起始细胞量太少或扩增偏差。
多样性与克隆性箱线图
在等深度下比较组间 Shannon 指数和克隆性。克隆性升高通常伴随多样性下降，提示抗原驱动的扩增；两者变化方向不一致时，先检查是否做了深度归一化。
V/J 基因使用热图
行为 V 基因，列为样本或分组。某些 V 基因在一组中集中升高，可能与特定抗原反应有关；若差异集中在某个测序批次，更可能是引物偏好或批次效应。
克隆追踪图
用线图或冲积图展示同一患者不同时间点高频克隆的频率变化。治疗后新出现并持续扩增的克隆值得重点关注；只在单一时间点出现的低频克隆多为抽样噪声。
单细胞克隆映射图
在 UMAP 上按克隆大小着色，扩增克隆常集中在效应或耗竭 CD8+ T 细胞等亚群。若扩增克隆均匀散布在所有亚群包括 B 细胞，需核查条形码匹配是否出错。
和相近方法怎么选
bulk 组库测序与单细胞 V(D)J
bulk 测序覆盖细胞多，适合估计多样性和检出低频克隆，但通常得不到 α/β 配对和细胞状态；单细胞可配对两条链并关联转录组表型，但细胞数有限。研究克隆表型选单细胞，研究多样性与追踪选 bulk。
专用组库测序与从 RNA-seq 提取
TRUST4、MiXCR 能从普通 RNA-seq 中提取 CDR3，适合挖掘 TCGA 等已有数据，但受体读段少，只能可靠捕获高丰度克隆。需要精确多样性或低频克隆时，应做专门的靶向组库测序。
免疫组库分析与免疫浸润分析
浸润分析估计 T、B 细胞有多少，组库分析回答这些细胞来自多少克隆、是否扩增。两者结合可以区分「T 细胞多但多克隆」和「T 细胞多且少数克隆主导」两种不同的免疫状态。
常见问题
免疫组库的克隆性和多样性有什么区别？
多样性指数（如 Shannon）同时反映克隆数量和分布均匀度；克隆性常定义为 1 减去标准化的 Shannon 熵，取值 0 到 1，越接近 1 表示越由少数克隆主导。两者大体呈反向关系，报告时最好同时给出并说明计算口径。
TCR 克隆型按核苷酸还是氨基酸序列定义？
研究抗原识别和公共克隆时，通常用 CDR3 氨基酸序列加 V 基因；需要区分不同细胞来源的趋同重排、研究克隆谱系时用核苷酸序列。两种口径都可以，关键是在所有样本中保持一致并在方法中写明。
单细胞 V(D)J 数据怎么和转录组结合？
以细胞条形码为键，把每个细胞的克隆型和克隆大小写入单细胞对象的元数据，再按亚群统计扩增程度。R 中常用 scRepertoire，Python 中常用 scirpy。合并前确认两个文件的条形码后缀和样本前缀一致。
下采样会不会损失信息？
会丢掉部分低频克隆，但这是让多样性指数可比的常用代价。可以多次随机下采样取均值，或用不依赖等深度的稀释外推方法作为补充；做克隆追踪时仍可使用原始深度的数据。
BCR 分析比 TCR 多了哪些内容？
BCR 在抗原刺激后会经历体细胞高频突变和同种型转换，所以除了克隆型和多样性，还常分析 V 基因突变率、IgM 到 IgG、IgA 的转换比例，并为同一克隆群构建谱系树，观察亲和力成熟的路径。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中说明数据类型、受体链和样本设计后，会先确认克隆型定义口径与深度归一化方案，再进行 TCR 与 BCR 免疫受体库分析，完成克隆型统计和 V/J 基因使用分析；随后进行多样性与克隆追踪分析，计算多样性指数和样本间重叠，追踪跨时间点或跨组织的克隆变化。交付频率分布图、多样性箱线图、追踪图、克隆型表、报告和可复现脚本。
我有 12 名患者免疫治疗前后的外周血 TRB 组库测序数据，想比较应答组和非应答组的克隆性，并追踪治疗后扩增的克隆。