单细胞细胞类型注释：Marker 与自动注释
细胞类型注释是给聚类得到的细胞群或单个细胞赋予生物学身份，例如 CD4 T 细胞、经典单核细胞、成纤维细胞。主要有三种思路：一是基于 marker 基因手动注释，依据文献和数据库中的经典标志基因判断每个簇的身份；二是基于参考表达谱的自动注释，如 SingleR 用已标注的 bulk 或单细胞参考数据，按相关性给每个细胞打标签；三是基于预训练模型或参考图谱映射，如 CellTypist 用逻辑回归模型分类，Seurat 和 Azimuth 把查询数据投影到参考图谱。实际中常先自动注释给出候选，再用 marker 逐簇核对。
什么时候用
- 完成聚类后需要给每个簇命名，用于作图和后续分析
- 研究免疫细胞等有成熟参考图谱的组织，可用自动注释提速
- 大规模数据簇很多，手动逐个判断效率低
- 需要统一多个数据集的细胞类型命名，便于跨研究比较
- 怀疑某簇是罕见或未报道的细胞状态，需要多方法交叉验证
不适合的情况
- 参考数据集不含目标组织的细胞类型时，自动注释会强行给出最相近但错误的标签
- 仅凭一两个 marker 定性亚群，单个基因在不同组织中的特异性可能不同
- 肿瘤细胞的恶性与否不能靠注释判断，应结合 CNV 推断等方法
需要准备的数据
- 聚类后的单细胞对象
- 含归一化表达、聚类标签和 UMAP 坐标的 Seurat 对象或 h5ad 文件
- 归一化表达矩阵
- CellTypist 要求每个细胞归一化到 10000 总计数并取 log1p；SingleR 使用对数归一化表达
- 参考数据集或模型
- 如 celldex 中的参考集、CellTypist 预训练模型、组织对应的已注释单细胞图谱
- marker 基因清单
- 来自文献或 CellMarker、PanglaoDB 等数据库，按物种和组织整理，基因名与数据一致
分析步骤
- 1
确定注释粒度
先决定标签层级，如先标注 T、B、髓系等大类，再在大类内注释亚群。分层注释可减少大类间的混淆，也便于后续针对某一大类子集再聚类。
- 2
找每个簇的 marker
用 Seurat 的 FindAllMarkers 或 Scanpy 的 rank_genes_groups 找各簇上调基因，优先看表达比例和倍数变化都高的基因，排除线粒体和核糖体基因。主要簇都应有能对应已知类型的 marker。
- 3
运行自动注释
SingleR 以参考集表达谱逐个细胞打分，可按簇聚合后注释以提高稳定性；CellTypist 选择匹配组织的模型，可开启 majority_voting 按过聚类结果投票。保存每个细胞的得分或概率，供后续筛查低置信度细胞。
- 4
参考图谱映射
有高质量同组织参考图谱时，可用 Seurat 的 FindTransferAnchors 和 MapQuery 或 Azimuth 把数据投影到参考空间并转移标签。映射后查看预测得分，得分低的细胞可能是参考中缺失的类型。
- 5
marker 逐簇核对
用点图展示每个候选类型的经典 marker，如 CD3E、MS4A1、CD14、NKG7、PPBP。自动注释标签与 marker 一致的簇直接采用；不一致的簇以 marker 为主，并查看它在两种方法中的得分分布。
- 6
处理未知与可疑簇
得分普遍低或 marker 混杂的簇，先排查是否为残留双细胞或低质量细胞；排除后仍无法对应已知类型的，标为待定并单独分析其 marker，不要强行套用参考标签。
- 7
整理最终标签
把确定的标签写入元数据，统一命名规则和大小写。输出带标签的 UMAP、marker 点图和每类细胞数统计，并在方法中注明所用参考集或模型及版本。
关键参数与决策
参考数据集选择
参考应与查询数据的物种、组织和测序技术接近。celldex 的 HumanPrimaryCellAtlasData 覆盖广但粒度粗，MonacoImmuneData 更适合免疫细胞细分。参考缺少目标类型时，算法无法给出正确标签。
逐细胞还是逐簇注释
逐细胞注释能发现簇内混杂，但噪音大；逐簇注释更稳定，却会掩盖簇内异质性。常用做法是两者都做，以逐簇结果为主，用逐细胞结果检查簇是否需要拆分。
CellTypist 模型与 majority_voting
模型按组织和粒度区分，如免疫细胞有高、低两个粒度的模型。开启 majority_voting 后，会在过聚类的小群内取多数标签，结果更平滑，但可能抹掉少量稀有细胞。
低置信度过滤
SingleR 提供 pruned.labels，会把得分差异过小的细胞标为 NA；CellTypist 输出每类概率。可按得分或概率设阈值，把低置信度细胞标为未确定，而不是全部接受最高分标签。
常见错误
- 用免疫细胞参考集注释实体瘤组织：上皮、成纤维、内皮等细胞会被强行标成最相近的免疫类型，造成整类细胞注释错误。
- 只看自动注释结果不核对 marker：参考集和查询数据的批次差异会让部分簇的标签系统性偏移，审稿人常要求提供 marker 证据。
- 把一个 marker 当作唯一依据：如 CD4 在人单核细胞上也有表达，FOXP3 在少量活化 T 细胞中也会出现，应使用一组 marker 综合判断。
- 基因命名不一致：小鼠数据配人类参考、Ensembl ID 配基因符号，都会导致大量基因无法匹配，自动注释结果几乎随机。
- 未先去除双细胞就注释：双细胞簇会同时匹配两类标签，被误命名为新的过渡态或混合细胞群。
- 参考映射得分低的细胞被直接赋予最高分标签：这些往往是参考中不存在的细胞类型，应单独标记并分析。
结果怎么看
注释后的 UMAP
按最终细胞类型着色。同一类型应形成连贯区域，相邻类型在生物学上通常相关，如各 T 细胞亚群靠近。某一类型被分散在多个远离的区域时，检查是否混入了不同来源的细胞或标签有误。
marker 点图
行为细胞类型，列为经典 marker，点大小为表达比例，颜色为平均表达。理想情况下呈对角块状；某类型在多组 marker 上都有中等表达，提示它可能是双细胞或注释粒度不够。
SingleR 得分热图
plotScoreHeatmap 展示每个细胞与各参考标签的相关得分。最高分明显高于次高分的细胞注释可靠；多个标签得分接近的细胞，说明参考集无法区分它们，应结合 marker 判断。
多方法一致性表
对比 SingleR、CellTypist 与 marker 手动注释的标签交叉表。大部分细胞应落在对角线上；集中出现在非对角的簇需重点复核，通常是参考粒度或命名体系不同造成的。
和相近方法怎么选
Marker 手动注释与自动注释
手动注释可解释性强，能处理参考中没有的细胞类型，但耗时且依赖经验。自动注释速度快、可复现，但受参考集限制。推荐用自动注释给候选标签，再用 marker 逐簇确认，最终结论以 marker 证据为准。
SingleR 与 CellTypist
SingleR 是 R 包，按与参考表达谱的相关性打分，可用任意 bulk 或单细胞参考。CellTypist 是 Python 工具，用预训练逻辑回归模型，免疫模型完善、速度快。有匹配模型时用 CellTypist 方便，需自定义参考时 SingleR 更灵活。
标签转移与参考图谱映射
SingleR、CellTypist 只给出标签；Seurat 参考映射、Azimuth 或 scArches 还会把查询细胞投影到参考的低维空间，便于在统一坐标中比较。映射更依赖参考质量，参考与查询批次差异大时需谨慎解读。
常见问题
单细胞注释用 SingleR 还是 CellTypist？
看组织和参考资源。免疫细胞数据可直接用 CellTypist 的免疫模型；其他组织有合适 bulk 或单细胞参考时，用 SingleR 更灵活。两者可同时运行，结果一致的簇可信度更高，不一致的再用 marker 判断。
自动注释和 marker 判断冲突时听谁的？
通常以 marker 为准，但要检查 marker 选得是否合适。冲突常来自参考集缺少该细胞类型、参考粒度过粗或命名体系不同。可查看该簇的自动注释得分，若最高分也不高，说明参考本身不适用。
常用的人类免疫细胞 marker 有哪些？
常用的有：T 细胞 CD3E、CD3D，B 细胞 MS4A1、CD79A，NK 细胞 NKG7、GNLY，经典单核细胞 CD14、LYZ，非经典单核细胞 FCGR3A，树突状细胞 FCER1A，血小板 PPBP，浆细胞 MZB1、JCHAIN。具体组织中应结合文献调整。
找不到对应细胞类型的簇怎么命名？
先排除双细胞、低质量细胞和应激细胞。确认是高质量细胞后，可按其 top marker 命名，如某基因高表达的成纤维细胞亚群，并在文中说明依据。不建议强行套用已知类型名称。
小鼠数据可以用人类参考注释吗？
不建议直接用。需先做同源基因转换，且跨物种表达差异会降低准确性。优先选择小鼠参考，如 celldex 中的小鼠参考集或已发表的小鼠组织图谱。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明物种、组织和已有聚类结果后，会先确认参考集或模型以及注释粒度。随后进行单细胞类型注释与参考映射：用参考数据或预训练模型给细胞打标签，结合 marker 逐簇核对，标出低置信度细胞群。交付注释 UMAP、marker 点图、注释得分图、多方法一致性表、细胞数统计、带标签的数据对象和可复现脚本。
我的 PBMC 单细胞数据已聚成 12 个簇，帮我用 SingleR 和 CellTypist 注释，再用经典 marker 核对，冲突的簇单独列出
