单细胞批次效应校正与多样本整合
批次效应是指样本因处理日期、建库批次、测序平台、实验室或个体不同而产生的系统性技术差异。在单细胞数据中，它表现为同一种细胞在 UMAP 上按样本分开，聚类按批次而不是细胞类型划分。整合的目标是在共享的低维空间里让同类细胞混在一起，同时保留不同细胞类型和真实条件差异。常用方法有 Harmony、scVI、Seurat 锚点整合、fastMNN、BBKNN 和 Scanorama 等。多数方法输出的是校正后的低维嵌入，用于聚类和可视化，而不是可直接做差异分析的校正表达矩阵。
什么时候用
- 多个病人或多个批次的样本合并后，同类细胞在 UMAP 上按样本分开
- 整合不同实验室或不同平台的公共单细胞数据，构建统一图谱
- 多队列联合分析，需在共享空间中比较细胞类型和比例
- 把新数据映射到已有参考图谱，统一注释体系
- 样本数多、细胞数达数十万，需要可扩展的整合方法
不适合的情况
- 分组与批次完全混杂（如所有病例在一批、对照在另一批），校正会同时消除生物学差异
- 只有单个样本或批次差异很小，强行整合可能引入不必要的扭曲
- 期望用整合后的嵌入或校正值直接做差异表达检验，结果会失真
需要准备的数据
- 合并后的计数矩阵
- 各样本质控后的原始计数合并为一个对象，基因名统一；scVI 需要原始整数计数
- 批次标签
- 每个细胞所属批次的元数据列，批次的定义要对应主要技术来源，如样本、通道或实验室
- 生物学协变量
- 疾病状态、组织部位、处理等，用于检查整合后这些差异是否被保留
- 细胞类型标签（可选）
- 已有初步注释时，可用于评估整合效果或作为 scANVI 等半监督方法的输入
分析步骤
- 1
评估是否需要整合
先不整合，直接做 PCA 和 UMAP，按样本、批次和初步细胞类型着色。若同一细胞类型按批次明显分开，说明存在需要校正的批次效应；若各样本已混合良好，可不整合。
- 2
确定批次变量
明确批次是以样本、建库批次还是实验室为单位。批次与研究分组完全重合时，任何方法都无法区分技术和生物学差异，需在设计层面说明局限，而不是依赖算法。
- 3
选择整合方法
数据量中等、希望快速可解释时用 Harmony；样本多、批次复杂或需要概率建模时用 scVI；需映射参考时考虑 scArches 或 Seurat 参考映射。可同时跑两种方法比较，选既能混合批次又保留细胞类型结构的结果。
- 4
运行整合
Harmony 以 PCA 结果和批次标签为输入，输出校正后的嵌入。scVI 在原始计数上训练模型，设置 batch_key，提取潜在表示。训练时观察损失曲线是否收敛，未收敛的模型嵌入不稳定。
- 5
基于整合嵌入聚类
用整合后的嵌入代替原始 PCA 构建近邻图，再做聚类和 UMAP。判断标准：同一细胞类型的不同样本细胞混在一起，不同细胞类型依然分开。
- 6
定量评估整合效果
用 iLISI 衡量批次混合程度，用 cLISI 或细胞类型轮廓系数衡量生物学结构保留，必要时计算 kBET 或 ARI。scIB 等基准框架提供了一组标准指标，用于在多方法间比较。
- 7
检查过度校正
查看已知只在某一条件出现的细胞群是否仍然独立，已知差异基因在整合后的簇中是否仍可检测。若稀有或条件特异细胞被并入其他群体，说明校正过度，应降低校正强度或换方法。
关键参数与决策
批次变量的层级
以样本为批次会去除个体间差异，以实验室为批次则保留同实验室内的个体差异。层级越细，校正越强，越可能抹掉个体间真实生物学变异。应按主要技术变异来源选择。
Harmony 的 theta
theta 控制多样性惩罚强度，值越大越强调批次混合，默认值为 2。批次效应强时可适当增大，但过大易导致不同细胞类型被拉到一起。调整后需重新检查细胞类型是否仍可分开。
scVI 潜在维度与网络结构
n_latent 决定潜在空间维度，默认 10，细胞类型复杂的大数据集可增加到 20 到 30。n_layers 等网络参数通常保持默认。训练轮数随数据量调整，以验证集损失稳定为准。
整合用的高变基因
建议在每个批次分别计算高变基因再合并选择，避免选入只在某一批次高表达的基因。高变基因包含大量批次特异基因时，整合效果会显著变差。
协变量处理
scVI 可以加入连续或分类协变量，如线粒体比例或供体。只把技术变量作为协变量；把疾病状态等研究变量加入批次校正，会直接去掉要研究的信号。
常见错误
- 把疾病分组当作批次变量校正：病例和对照之间的真实差异会被当作技术噪音去除，后续组间比较失去意义。
- 用 Harmony 嵌入或整合后的校正矩阵做差异表达：这些值已被改变，方差结构失真，P 值不可信；差异分析应回到原始计数并把批次作为协变量。
- 只用 UMAP 图好不好看判断整合效果：UMAP 可能掩盖过度校正，需结合 LISI 等定量指标和已知生物学差异是否保留。
- 各样本质控标准不一致就直接整合：低质量细胞多的样本会形成独立群体，被误判为批次效应并被强行校正。
- 批次和细胞类型组成高度不平衡时用强校正：某批次特有的细胞类型会被拉向其他批次的相近类型，出现错误合并。
- 用 scVI 时输入归一化后的数据：scVI 模型假设输入为原始计数，输入对数化数据会让似然模型失效，潜在表示不可靠。
结果怎么看
整合前后 UMAP 对比
按批次着色时，整合后各批次的细胞应在同一细胞类型区域内交织；按细胞类型着色时，类型边界应依然清楚。整合后不同类型混成一团，说明校正过度。
批次混合与生物保留指标
iLISI 越高表示批次混合越好，cLISI 越接近 1 表示同类细胞邻居越纯。两类指标通常相互权衡，好的整合在两者之间取得平衡，而不是只追求批次混合最大。
各簇样本组成堆叠图
展示每个簇中来自各样本的细胞比例。整合良好时，大多数簇包含多个样本；仅由单一样本构成的簇需结合 marker 判断是真实的样本特异细胞还是残余批次效应。
跨队列元分析汇总表
多队列整合后按队列分别统计细胞类型比例或差异结果，再进行汇总。表中关注效应方向在各队列是否一致，以及异质性大小；只在单个队列显著的结论需要谨慎解读。
和相近方法怎么选
Harmony 与 scVI
Harmony 在 PCA 空间迭代校正，速度快、内存小，Seurat 和 Scanpy 都能用。scVI 对原始计数建概率模型，适合复杂批次和大规模数据，还可用于去噪，但需要训练，建议用 GPU。批次结构简单时 Harmony 通常足够。
Seurat 锚点整合与 Harmony
Seurat 用 CCA 或 RPCA 寻找跨批次的相互近邻锚点进行校正。CCA 校正较强，适合差异大的数据但易过度校正；RPCA 更保守、速度更快。Harmony 只改低维嵌入，计算更轻，在多个基准中表现稳定。
批次整合与批次作为协变量
整合方法解决的是聚类和可视化中细胞的对齐问题。差异表达分析中处理批次的正确方式是在统计模型中加入批次协变量，如 pseudobulk 后在 DESeq2 设计公式中加入批次，而不是使用整合后的数值。
常见问题
怎么判断单细胞数据有没有批次效应？
不整合时按样本或批次给 UMAP 着色。如果同一种细胞（例如 T 细胞）按样本分成几团，或聚类结果与样本高度对应，就存在明显批次效应。也可计算批次标签的 LISI 等指标做定量判断。
Harmony 整合后可以做差异表达吗？
可以做，但不应使用 Harmony 的嵌入值。Harmony 只校正低维嵌入，表达矩阵本身不变。差异分析应用原始计数，并在模型中把批次或样本作为协变量；比较组间差异时推荐用 pseudobulk 方法。
整合后某些细胞类型消失了怎么办？
这通常是过度校正。只在部分批次存在的细胞类型被并入了其他群体。可降低校正强度，如减小 Harmony 的 theta，或换用更保守的方法，并用 marker 检查这类细胞在整合前后的位置。
公共数据和自己的数据能一起整合吗？
可以，但要确认基因注释版本一致、质控标准一致，并注意建库平台差异。若公共数据已有高质量注释，可考虑参考映射而非对称整合，这样能保持参考结构并把自己的数据投影上去。
批次和分组完全重合还能校正吗？
无法从数据中区分技术和生物学差异，任何方法都不能可靠校正。此时应如实说明设计局限，考虑以细胞类型内相对比较为主，或补充跨批次的样本来解开混杂。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明样本数量、批次来源和研究分组后，会先确认批次变量和整合方法。随后进行单细胞批次整合，可用 Harmony 等方法或 scVI 概率建模生成整合嵌入并在其上聚类；多队列数据可做跨队列整合与元分析。交付整合前后 UMAP、批次混合与结构保留指标、各簇样本组成图、跨队列汇总表、整合后数据对象和可复现脚本。
我有 3 个医院共 12 例结直肠癌单细胞样本，按医院有明显批次效应，帮我分别用 Harmony 和 scVI 整合，并比较 LISI 指标选更合适的结果