单细胞数据质控：双细胞、环境 RNA 与线粒体比例
单细胞质控是在聚类和注释之前，把不代表单个完整活细胞的条形码剔除或校正掉。液滴法（如 10x Genomics）测出的矩阵里混有三类问题：一是空液滴和破损细胞，表现为 UMI 少、基因少、线粒体读段比例高；二是双细胞，即一个液滴包进两个细胞，表达谱看起来像两种细胞的混合；三是环境 RNA，裂解细胞释放到悬液里的游离 RNA 被所有液滴捕获，使每个细胞都带上少量高表达基因的背景信号。典型输入是 Cell Ranger、STARsolo 或 alevin-fry 输出的计数矩阵。质控不到位，后续会出现由低质量细胞或双细胞组成的假亚群。
什么时候用
- 拿到 10x 等液滴法原始计数矩阵，准备做聚类和注释之前
- UMAP 上出现一群 marker 混杂、来源不明的小簇，怀疑是双细胞
- 血红蛋白或免疫球蛋白基因在所有细胞里都有表达，怀疑环境 RNA 污染
- 组织解离时间长、细胞活率低，需要判断有多少应激或濒死细胞
- 多个样本合并分析前，逐样本比较测序质量是否一致
- 下载 GEO 公共单细胞数据后，复核原作者的过滤是否足够
不适合的情况
- 已经是作者过滤并归一化后的矩阵，再套一遍严格阈值会重复过滤，丢掉真实细胞
- 单细胞核测序（snRNA-seq）照搬单细胞线粒体阈值：细胞核数据线粒体读段本就极少，阈值逻辑不同
- 想用质控指标比较组间生物学差异，质控指标受实验操作影响大，不适合做结论
需要准备的数据
- 过滤后计数矩阵
- Cell Ranger 的 filtered 矩阵或 h5 文件，须为原始 UMI 计数，不能是归一化值
- 未过滤原始矩阵
- raw_feature_bc_matrix，含空液滴；SoupX 和 CellBender 估计背景污染时需要它
- 样本信息表
- 每个条形码所属样本、测序通道和分组；双细胞检测要按通道分开做
- 物种与基因命名
- 确认线粒体基因前缀，人类通常为 MT-，小鼠为 mt-；用 Ensembl ID 时需先映射基因名
分析步骤
- 1
计算质控指标
对每个细胞计算总 UMI 数、检测到的基因数和线粒体读段占比，必要时加血红蛋白基因占比。Scanpy 用 calculate_qc_metrics，Seurat 用 PercentageFeatureSet。先画小提琴图和散点图看分布，再定阈值。
- 2
逐样本设定阈值
低 UMI 低基因数多为空液滴或碎片，过高的 UMI 可能是双细胞。常用做法是按样本用中位数绝对偏差（MAD）找离群值，例如偏离中位数 3 到 5 个 MAD 视为离群。判断标准：过滤后各样本分布接近，没有成片砍掉某一类细胞。
- 3
线粒体比例过滤
线粒体占比高通常提示细胞膜破损、胞质 RNA 流失。阈值常见在 5% 到 20% 之间，心肌、肝脏、肾小管等高代谢组织天然偏高，需放宽。检查被过滤细胞在初步聚类中的位置，如果集中在某个真实细胞类型上，说明阈值过严。
- 4
环境 RNA 校正
用 SoupX 或 CellBender 从空液滴估计背景表达谱并从细胞中扣除。SoupX 需要初步聚类，可用 autoEstCont 估计污染比例；CellBender 基于原始矩阵建模。校正后 HBB、IGKC 等背景基因应只在对应细胞类型中表达。
- 5
双细胞检测
用 scDblFinder、Scrublet 或 DoubletFinder 模拟人工双细胞并给细胞打分。须对每个测序通道单独运行，因为双细胞只在同一通道内形成。被标记的细胞通常同时表达互斥 marker，如 CD3E 和 CD14。
- 6
过滤与复核
去除低质量细胞和双细胞后，再做一次快速聚类。检查是否还有以线粒体基因、核糖体基因或热休克基因为 top marker 的簇；如有，回到上一步调整阈值。最后记录每一步各样本保留的细胞数，便于写方法部分。
关键参数与决策
线粒体比例阈值
没有通用固定值。常见做法是先看分布再设，或用 MAD 自动判定。免疫细胞、PBMC 数据常用较严阈值，高代谢组织需放宽；snRNA-seq 中线粒体读段理论上应接近零，偏高说明核提取时混入胞质。
UMI 与基因数下限
下限用于去除空液滴和碎片，常见经验下限是几百个基因，但应看分布拐点。中性粒细胞等 RNA 含量低的细胞类型容易被一刀切掉，研究这些细胞时宜放宽下限。
预期双细胞率
双细胞率随上样细胞数增加而上升，10x 的经验值约为每回收 1000 个细胞增加 0.8% 左右。DoubletFinder 等工具需手动给出预期比例，设得过高会误删真实的过渡态细胞。
环境 RNA 污染比例
SoupX 的污染比例 rho 可自动估计，也可用 setContaminationFraction 指定。自动估计不稳时，用只在特定细胞类型表达的基因（如血红蛋白基因）辅助估计；比例过高会扣掉真实信号。
过滤顺序
常见顺序是先校正环境 RNA、再去双细胞、最后按指标过滤，但也有流程先粗过滤。关键是双细胞检测在含全部候选细胞的单个通道上运行，并且所有步骤保留原始计数供后续分析。
常见错误
- 把多个样本合并后再跑双细胞检测：不同通道的细胞不可能形成双细胞，合并后模拟的人工双细胞失真，导致漏检或误检。
- 所有样本统一一个固定阈值：测序深度不同的样本分布差异很大，低深度样本会被过度过滤，高深度样本里的低质量细胞却留了下来。
- 照搬 5% 线粒体阈值处理心肌或肝脏数据：这些组织的健康细胞线粒体占比本就高，会把大量真实细胞当作破损细胞删除。
- 环境 RNA 校正后直接把非整数矩阵送进需要整数计数的工具：SoupX 默认输出可能含小数，需要按需取整或改用对应选项。
- 把双细胞检测分数当作唯一标准：过渡态细胞和多能祖细胞也可能被打高分，删除前应核对其 marker 是否真的互斥。
- 只看过滤前后细胞数，不看过滤掉的是哪些细胞：如果某个细胞类型几乎全被去除，往往是阈值不适合该类型而不是数据质量问题。
结果怎么看
质控指标小提琴图
按样本展示 UMI 数、基因数、线粒体比例的分布。各样本中位数应大致接近；某个样本整体偏低或线粒体比例整体偏高，说明该样本建库或解离存在问题，应考虑单独处理或剔除。
UMI 与基因数散点图
横轴 UMI 数、纵轴基因数，按线粒体比例着色。正常细胞沿一条对数曲线分布；左下角低值、高线粒体的点多为破损细胞；UMI 高但基因数增长停滞的点可能是双细胞或高表达少数基因的细胞。
双细胞得分 UMAP
把双细胞得分或判定结果投到 UMAP 上。双细胞通常位于两个大群之间的连接处或形成小的孤立簇；如果某个大簇整体得分偏高，先检查它是否是 RNA 含量本就较高的细胞类型。
环境 RNA 校正前后对比
对比校正前后背景基因（如 HBB、LYZ、IGKC）在各簇中的表达。校正有效时，这些基因在非对应细胞类型中的表达明显下降，而在本该表达的细胞中保持；若对应细胞中的表达也大幅下降，说明扣除过度。
逐步过滤统计表
列出每个样本在每个步骤前后的细胞数和占比。某一步去除比例异常高时应回查原因；这张表也是论文方法部分和审稿回复中常被要求提供的内容。
和相近方法怎么选
SoupX 与 CellBender
SoupX 基于空液滴估计背景谱，需要聚类信息，运行快，污染比例可手动设定，便于解释。CellBender 用深度生成模型同时处理背景和空液滴识别，污染重时效果常更好，但计算量大，建议用 GPU。污染轻时 SoupX 通常够用。
scDblFinder、Scrublet 与 DoubletFinder
三者都靠模拟人工双细胞打分。scDblFinder 是 R 包，速度快、参数少；Scrublet 是 Python 工具，便于接入 Scanpy；DoubletFinder 依赖 Seurat 对象，需调 pK。它们主要识别异型双细胞，同型双细胞难以检出。
固定阈值与 MAD 自适应阈值
固定阈值简单、可复现，适合单样本或深度相近的数据；MAD 阈值按每个样本自身分布判定离群，更适合多样本、深度差异大的数据。实际中常两者结合：MAD 定初值，再按组织特性人工调整。
常见问题
单细胞线粒体比例阈值设多少合适？
没有统一标准。PBMC 等数据常用较严阈值，高代谢组织需明显放宽。建议先画线粒体比例分布，结合 MAD 离群判定和组织特性来定，再检查被过滤的细胞是否集中在某个真实细胞类型，以此修正阈值。
双细胞检测要在整合之前还是之后做？
在整合之前，且要对每个测序通道单独做。双细胞只在同一通道内产生，合并或整合后再检测会引入不可能存在的跨样本组合，结果不可靠。检测出的标签可以带到整合后的对象上用于复核。
SoupX 校正后的矩阵还能用 DESeq2 或 pseudobulk 吗？
可以，但要注意整数问题。SoupX 的调整矩阵可能含小数，用于需要整数计数的方法时可开启取整选项或自行取整。也有研究者只把校正矩阵用于聚类和可视化，差异分析仍用原始计数并在解读时考虑污染。
质控需要去除核糖体基因和细胞周期影响吗？
核糖体基因比例通常作为参考指标，不建议直接删除这些基因。细胞周期是否回归取决于研究问题：增殖本身是研究对象时不要回归；它干扰了细胞类型聚类时，可以对细胞周期打分并在后续步骤中作为协变量处理。
公共数据只给了过滤后的矩阵，还需要再质控吗？
需要复核，但不宜再套用严格阈值。先画质控指标分布，看是否残留高线粒体或疑似双细胞簇；如果没有原始矩阵，环境 RNA 校正无法用 SoupX 的标准流程，可在解读中注明这一局限。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明样本来源和数据位置后，会先确认质控方案，如线粒体阈值的定法和是否校正环境 RNA。随后完成 scRNA-seq 预处理：逐样本计算质控指标并按线粒体比例过滤，逐通道检测双细胞，用原始矩阵校正环境 RNA 污染。交付质控图、双细胞得分图、逐步过滤统计表、过滤后的数据对象和可复现脚本。
我有 4 个 10x 肝组织样本的 raw 和 filtered 矩阵，帮我逐样本定线粒体阈值、去双细胞、用 SoupX 校正环境 RNA，并统计每步保留的细胞数
