单细胞 RNA-seq 分析实战：PBMC 3k 免疫细胞图谱（Scanpy）

用科搭 Codar 生信模式分析 10x Genomics PBMC 3k 公开数据：质量控制、高变基因、PCA、Leiden 聚类、UMAP、细胞类型注释与 Marker 验证，附完整操作步骤和结果图。

更新于 2026-10-07单细胞RNA测序scRNA-seq分析PBMC 3kScanpy

#案例目标

使用公开的 10x Genomics PBMC 3k 单细胞 RNA 测序数据，完成质量控制、特征选择、降维聚类、细胞类型注释和 Marker 验证，构建可复现的健康人外周血免疫细胞图谱。

#研究背景

外周血单个核细胞（PBMC）包含 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、单核细胞和树突状细胞等免疫细胞。单细胞 RNA 测序可以同时观察不同细胞群的转录特征，是学习单细胞数据分析和免疫细胞注释的经典场景。

本案例使用数据量适中的 PBMC 3k 数据集，帮助用户快速跑通从原始表达矩阵到免疫图谱的完整流程。

#研究方法

使用 Scanpy 读取 10x 表达矩阵并计算每个细胞的基因数、UMI 数和线粒体基因比例。
按基因数 200–2,500、线粒体基因比例低于 20% 的条件过滤低质量细胞和潜在双细胞。
使用 CPM 标准化和 log1p 转换，并筛选高变基因。
对高变基因进行 PCA，使用前 30 个主成分构建邻居图。
使用 Leiden 算法聚类，并通过 UMAP 展示细胞分布。
根据经典 Marker 的表达模式完成细胞类型注释和交叉检查。

#研究目标

获得通过质量控制的高质量 PBMC 单细胞表达矩阵。
识别主要转录细胞群并完成免疫细胞类型注释。
使用经典 Marker 验证注释结果。
统计各免疫细胞类型的数量和比例。
输出可继续分析的 AnnData 对象、结果表、图件和脚本。

#拟解决的关键问题

原始 PBMC 数据经过质量控制后可保留多少细胞和基因？
无监督聚类能否分离主要免疫细胞群？
经典 Marker 的表达是否支持细胞类型注释？
各类免疫细胞在该样本中的组成比例如何？

#分析流程

下载并读取 10x PBMC 3k 表达矩阵。
计算质量控制指标并过滤低质量细胞。
完成标准化、log1p 转换和高变基因筛选。
运行 PCA、邻居图、Leiden 聚类和 UMAP。
检查经典免疫 Marker 并注释细胞类型。
绘制 Marker 和细胞比例图。
导出 AnnData 对象、结果表、图件和分析报告。

#数据准备

#数据来源

数据集：10x Genomics PBMC 3k 示例数据
样本：单一健康供体的外周血单个核细胞
原始规模：2,700 个细胞、32,738 个基因
参考基因组：hg19（GRCh37）
数据格式：10x Matrix Market 矩阵、基因和细胞条形码文件

#用户操作教程

#第一步：创建任务

打开 Codar，在左上角选择 生信模式。
点击 新对话，输入任务目标：

帮我基于公开单细胞 RNA 测序数据构建健康人外周血单个核细胞免疫图谱。

发送任务后，Codar 会梳理需求并确认分析方案。

选择生信模式并输入 PBMC 免疫图谱任务 — 操作示意 1：在生信模式中新建对话，并用一句话说明数据类型、研究对象和目标产出。

#第二步：选择数据源

在“数据源”问题中选择 10x Genomics 公开示例（推荐）。该数据集规模较小，适合快速跑通完整流程。已有指定数据时，可选择“其他”并补充本地路径或下载地址。

选择 10x Genomics 公开 PBMC 示例数据 — 操作示意 2：选择 10x Genomics PBMC 公开示例数据；使用自己的数据时，应同时提供样本信息和文件格式。

#第三步：选择分析深度

选择 完整标准流程（推荐），Codar 将执行质量控制、标准化、特征选择、降维聚类、细胞注释、Marker 验证和结果导出。

选择完整的单细胞 RNA 测序分析流程 — 操作示意 3：完整标准流程适合首次构建图谱；只检查数据时可选择基础流程。

#第四步：选择计算与交付方式

选择本机运行或先生成脚本，再点击 提交回答。本案例最终使用 Python Scanpy 完成计算，并同时保留脚本和结果文件。

选择本机运行并提交回答 — 操作示意 4：选择计算与交付方式。具体工具会根据分析方案和本机环境确定，本案例实际使用 Scanpy。

#第五步：查看任务计划

提交后，Codar 会生成任务计划并逐步执行。界面底部会显示当前步骤和整体进度；需要安装依赖或访问文件时，根据提示确认即可。

查看 PBMC 免疫图谱分析任务计划 — 操作示意 5：任务计划用于查看执行顺序、当前步骤和剩余工作。

#第六步：查看结果产出

任务完成后，报告、数据、图表和脚本会显示在右侧结果产出区。点击文件可直接预览，也可以导出整个会话。

案例一结果产出区功能说明 — 操作示意 6：结果产出区提供目录导航、文件预览、会话终端和打包导出功能。

#数据分析与结果

#数据质量控制

原始矩阵包含 2,700 个细胞和 32,738 个基因。过滤低质量细胞、潜在双细胞和低频基因后，保留 2,693 个细胞和 13,673 个基因，细胞保留率为 99.7%。

PBMC 过滤前质量控制指标 — Fig 1A：PBMC 原始数据过滤前的细胞质量分布

#标准化与高变基因筛选

表达矩阵经过总量标准化和 log1p 转换后，共筛选出 1,855 个高变基因。高变基因保留了细胞间差异较大的表达信号，用于后续降维和聚类。

PBMC 高变基因筛选结果 — Fig 1B：PBMC 数据标准化前后的高变基因筛选结果

#PCA 降维

对高变基因进行标准化和 PCA。前几个主成分贡献了主要变异，后续分析使用前 30 个主成分构建细胞邻居图。

PBMC PCA 方差贡献率 — Fig 1C：PCA 主成分方差贡献率及降维维数选择

#Leiden 聚类

使用 10 个近邻和 Leiden resolution 0.5 对细胞聚类，共识别出 7 个转录细胞群。UMAP 显示主要细胞群之间具有清晰分离，小群体仍保持独立结构。

#细胞类型注释

根据各簇的经典 Marker 表达，将细胞归并为 CD4 T、NK、B、Monocyte、DC 和 Platelet 六类主要细胞。注释同时参考聚类点图、细胞类型点图和 Marker 表达分布。

各 Leiden 簇的经典 Marker 表达 — Fig 3A：经典免疫细胞 Marker 在各 Leiden 簇中的表达点图

各细胞类型的经典 Marker 表达 — Fig 3B：经典 Marker 在各免疫细胞类型中的表达点图

不同细胞类型的 Marker 表达分布 — Fig 3C：代表性 Marker 在不同免疫细胞类型中的表达分布

#关键 Marker 的空间验证

单基因 UMAP 可直观看到 Marker 在转录空间中的定位。Marker 信号与对应细胞群重合，进一步支持注释结果。

CD3D 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4A：T 细胞 Marker CD3D 的 UMAP 表达分布

CD8A 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4B：细胞毒性淋巴细胞 Marker CD8A 的 UMAP 表达分布

NKG7 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4C：NK 细胞 Marker NKG7 的 UMAP 表达分布

GNLY 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4D：NK 细胞 Marker GNLY 的 UMAP 表达分布

MS4A1 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4E：B 细胞 Marker MS4A1 的 UMAP 表达分布

CD14 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4F：单核细胞 Marker CD14 的 UMAP 表达分布

FCER1A 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4G：树突状细胞 Marker FCER1A 的 UMAP 表达分布

PPBP 在 PBMC UMAP 中的表达 — Fig 4H：血小板 Marker PPBP 的 UMAP 表达分布

#细胞类型组成

CD4 T 细胞数量最多，占 43.85%；单核细胞占 24.14%；NK 细胞占 17.27%；B 细胞占 12.92%；DC 和 Platelet 分别占 1.34% 和 0.48%。

细胞类型	细胞数	占比
CD4 T	1,181	43.85%
Monocyte	650	24.14%
NK	465	17.27%
B	348	12.92%
DC	36	1.34%
Platelet	13	0.48%

PBMC 细胞类型比例 — Fig 5A：PBMC 主要免疫细胞类型的数量及组成比例

#结果文件

results/ANALYSIS_REPORT.md：完整分析报告
results/pbmc_immune_atlas.h5ad：包含表达矩阵、PCA、UMAP、聚类和注释的 AnnData 对象
results/cell_type_proportions.csv：细胞类型数量与比例
results/figures：质量控制、聚类、注释和 Marker 图件
scripts/pbmc_immune_atlas.py：可复现分析脚本

#结果总结

本案例从 2,700 个原始 PBMC 中获得 2,693 个高质量细胞，并识别出 7 个 Leiden 簇和 6 类主要免疫细胞。CD4 T 细胞占比最高，其次为单核细胞、NK 细胞和 B 细胞。多种 Marker 可视化结果共同支持主要细胞类型注释，说明完整流程已成功跑通。

#使用建议

初次体验可直接使用推荐选项，先完成整个流程，再调整参数。
使用自己的数据时，应补充样本来源、物种、测序平台、分组信息和文件路径。
注释时不要只看单个 Marker，应同时检查多个阳性和阴性 Marker。
多样本整合时应增加批次校正、供体分层和注释一致性评估。
后续可基于 pbmc_immune_atlas.h5ad 开展亚群细分和差异表达分析。