单细胞伪 bulk 差异表达实战：IFN-β 刺激 PBMC 响应分析（GSE96583）

基于 GSE96583 单细胞数据，按供体配对做伪 bulk 差异表达和 ISG 评分，比较 IFN-β 刺激后 8 类 PBMC 的响应强度、共享差异基因与细胞类型特异性响应。

更新于 2026-10-07伪bulk差异分析pseudobulk单细胞差异表达IFN-β

#案例目标

基于公开单细胞转录组数据 GSE96583，比较 IFN-β 刺激组与对照组，识别不同 PBMC 细胞类型的干扰素响应强度、共享响应程序和细胞类型特异性差异表达特征。

#研究背景

I 型干扰素能够快速启动抗病毒、抗原呈递和免疫调节程序，但不同免疫细胞的响应强度与下游功能并不完全相同。传统整体转录组分析会混合各种细胞的表达变化，难以区分响应来自哪类细胞。

本案例使用 8 名系统性红斑狼疮患者的 PBMC 数据。每名供体的样本均分为 IFN-β 刺激 6 小时和 mock 对照两组，可在供体配对设计下分析细胞类型特异性响应。

#研究方法

读取 GSE96583 batch 2 的对照组和刺激组表达矩阵，并整合作者提供的供体、条件和细胞类型注释。
去除 demuxlet 标记的 doublet、ambiguous 细胞及低基因数细胞，保留高质量 singlet。
使用经典 Marker、Leiden 聚类与作者注释交叉检查细胞类型标签。
计算核心干扰素刺激基因（ISG）模块评分，并按供体比较刺激前后的变化。
将原始计数按“细胞类型 × 供体 × 条件”汇总，进行供体配对的伪 bulk 差异表达分析。
比较共享差异基因与细胞类型独有差异基因，并使用细胞级 Wilcoxon 检验进行敏感性验证。

#研究目标

获得经过质量控制并保留供体配对信息的 PBMC 单细胞数据。
确认主要免疫细胞类型及刺激组、对照组的细胞分布。
比较不同细胞类型的 ISG 响应强度和供体间一致性。
识别 IFN-β 刺激后的共享转录响应与细胞类型特异性响应。
输出可复查的图件、结果表、AnnData 对象和分析脚本。

#拟解决的关键问题

IFN-β 是否会在所有主要 PBMC 细胞类型中引发显著响应？
哪些细胞类型的 ISG 和趋化因子响应最强？
哪些差异表达基因由多种细胞共享，哪些仅出现在特定细胞类型中？
供体配对的伪 bulk 结果与细胞级分析是否保持一致？

#分析流程

下载并解析 GSE96583 batch 2 表达矩阵和元数据。
合并刺激组与对照组，核对供体和细胞条形码。
去除低质量细胞、doublet 和 ambiguous 细胞。
完成标准化、降维、聚类及细胞类型注释验证。
计算核心 ISG 与趋化因子模块评分。
按供体配对比较各细胞类型的刺激响应。
进行细胞类型分层的伪 bulk 差异表达分析。
比较共享与特异性差异基因，并进行敏感性验证。
导出图表、结果文件和可复现脚本。

#数据准备

#数据来源

数据集：GSE96583 batch 2
研究对象：8 名系统性红斑狼疮患者的 PBMC
实验设计：每名供体均包含 mock 对照与 IFN-β 刺激 6 小时样本
原始规模：29,065 个细胞、35,635 个基因
对照组：14,619 个细胞
刺激组：14,446 个细胞

#用户操作教程

#第一步：创建任务

打开 Codar，在左上角选择 生信模式。
点击 新对话，输入任务目标：

帮我基于 GSE96583 单细胞转录组数据，解析 IFN-β 刺激后 PBMC 的细胞类型特异性响应。

发送任务后，补充确认数据集、刺激条件、配对信息和期望产出。

创建 IFN-β 刺激 PBMC 响应分析任务 — 操作示意 1：在生信模式中新建对话，并说明数据集、刺激条件和分析目标。

#第二步：确认分析方案

建议在方案确认时保留以下设置：

数据集：GSE96583 batch 2
比较方式：IFN-β 刺激 6 小时与 mock 对照
实验设计：8 名供体配对比较
分析内容：质控、注释验证、ISG 评分、响应排序、伪 bulk 差异表达和特异性分析
统计要求：按细胞类型分析并进行 BH 多重检验校正

确认后提交回答，Codar 会生成执行计划并开始运行。

#第三步：查看运行过程

运行过程中可在工作区查看下载的数据、分析脚本和当前任务进度。分析中断时，可在原对话输入“继续运行”，Codar 会检查已经生成的文件并从可继续的位置恢复。

#第四步：查看结果文件

任务完成后，在结果产出区依次查看分析报告、结果图、统计表和脚本。点击文件可直接预览，也可以导出整个项目。

查看 IFN-β 刺激后的细胞类型特异性响应结果 — 操作示意 2：在结果产出区查看案例三的报告、图表、数据表和可复现脚本。

#数据分析与结果

#数据质量控制与注释验证

合并后的原始数据包含 29,065 个细胞和 35,635 个基因。去除 demuxlet 标记的 doublet、ambiguous 细胞和低基因数细胞后，保留 24,562 个 singlet 和 15,701 个基因。

最终包含 CD4 T、CD8 T、B、NK、CD14+ Monocyte、FCGR3A+ Monocyte、DC 和 Megakaryocyte 八类细胞。Leiden 聚类与作者注释的主要簇对应良好，簇纯度中位数为 0.93；经典 Marker 表达也支持各细胞类型标签。

PBMC 细胞类型、刺激条件和 ISG 评分 UMAP — Fig 1A：PBMC 细胞类型、刺激条件及核心 ISG 模块评分的 UMAP 图

#IFN-β 响应的细胞类型差异

所有主要细胞类型在刺激后均表现出显著的 ISG 评分升高。8 名供体的配对 Wilcoxon 检验在各细胞类型中均为 p = 0.0078，说明响应方向在供体间保持一致。

不同细胞类型刺激前后的 ISG 评分 — Fig 2A：不同 PBMC 细胞类型在 IFN-β 刺激前后的核心 ISG 评分

髓系细胞的绝对响应最强。按 ΔISG 从高到低排序，依次为 CD14+ Monocyte、DC、FCGR3A+ Monocyte、B、NK、Megakaryocyte、CD4 T 和 CD8 T。CD14+ Monocyte 的 ΔISG 为 1.51，CD8 T 为 0.83，整体响应幅度相差接近两倍。

细胞类型	对照组均值	刺激组均值	ΔISG	Δ趋化因子评分	刺激组 IFN-high 比例
CD14+ Monocyte	-0.08	1.42	1.51	2.27	100.0%
DC	-0.20	1.25	1.45	1.00	100.0%
FCGR3A+ Monocyte	0.11	1.47	1.36	1.48	99.1%
B	-0.14	0.97	1.12	0.57	99.1%
NK	-0.06	0.93	0.99	0.21	97.7%
Megakaryocyte	-0.15	0.72	0.87	0.48	92.0%
CD4 T	-0.16	0.70	0.86	0.29	99.4%
CD8 T	-0.11	0.71	0.83	0.18	97.1%

不同 PBMC 细胞类型的 IFN-β 响应强度排序 — Fig 2B：不同 PBMC 细胞类型的 ISG、趋化因子及 IFN-high 响应强度排序

趋化因子模块同样呈现明显的细胞类型差异。CD14+ Monocyte 和 FCGR3A+ Monocyte 的 Δ趋化因子评分分别为 2.27 和 1.48，而 T/NK 细胞约为 0.18–0.29，提示单核细胞是主要的趋化因子输出来源。

#伪 bulk 差异表达分析

原始计数按“细胞类型 × 供体 × 条件”汇总为伪 bulk 数据，并在供体内进行配对比较。显著差异基因的判断标准为 FDR < 0.05 且 |log2FC| ≥ 0.58。DC 因部分供体细胞数不足使用 6 对样本；Megakaryocyte 仅有 208 个细胞，配对供体不足，因此未进行差异表达检验。

CD14+ Monocyte 的转录变化范围最大，共检出 966 个上调基因和 2,896 个下调基因；CD8 T 的变化最少，共检出 59 个上调基因和 8 个下调基因。

不同细胞类型的伪 bulk 差异表达热图 — Fig 3A：不同 PBMC 细胞类型代表性差异基因的伪 bulk 表达热图

不同细胞类型的伪 bulk 差异表达火山图 — Fig 3B：不同 PBMC 细胞类型 IFN-β 刺激效应的伪 bulk 差异表达火山图

主要细胞类型的差异表达结果如下：

细胞类型	显著上调	显著下调	代表性上调基因
CD14+ Monocyte	966	2,896	CXCL10、CCL8、CXCL11、IFIT1、IFIT2、RSAD2
FCGR3A+ Monocyte	489	480	CCL8、CXCL11、IFIT1、DEFB1、RSAD2、IL27
CD4 T	358	288	CXCL10、RSAD2、IFIT3、IFIT1、CCL8、CMPK2
B	219	107	CXCL10、IFIT3、RSAD2、IFIT1、IFIT2、CXCL11
DC	166	89	CXCL10、IFIT2、CXCL11、IFIT3、IFIT1、TNFSF10
NK	114	66	CXCL10、IFIT1、CCL8、CMPK2、RSAD2、IFI44L
CD8 T	59	8	RSAD2、CXCL10、IFIT1、IFIT3、IFIT2、IFI44L

#共享响应与细胞类型特异性响应

共有 35 个基因在 7 类参与差异表达分析的细胞中一致显著上调，包括核心 ISG、抗原呈递相关基因、趋化因子和负反馈调控基因。CXCL10、CCL8、IFIT1、IFIT2、IFIT3、RSAD2 和 CMPK2 等构成 IFN-β 刺激后的共享响应层。

细胞类型特异性响应以 CD14+ Monocyte 最丰富，共有 2,776 个独有显著差异基因；FCGR3A+ Monocyte 有 100 个，CD4 T 有 203 个。CD8 T 没有独有上调基因，说明其响应主要集中于多种细胞共享的 ISG 程序。

下调基因未形成 7 类细胞一致显著的共享集合，但核糖体和翻译相关基因在各细胞类型中整体呈下降方向，且显著下调的规模随响应强度增加。

#敏感性分析

供体级伪 bulk 与细胞级 Wilcoxon 分析的 logFC Spearman 相关系数为 0.68–0.91，各细胞类型的变化方向总体一致。该结果支持以供体配对的伪 bulk 分析作为主要结论，同时避免把大量单细胞当作完全独立样本造成伪重复。

#生物学解读

单核细胞和 DC 同时表现出较强的 ISG 诱导和趋化因子输出，是本数据中 IFN-β 响应最明显的细胞群。
T 细胞和 NK 细胞仍可启动共享 ISG 程序，但整体转录变化和类型独有程序少于髓系细胞。
CXCL10、CCL8 和多种 IFIT 家族基因在多个细胞类型中共同上调，构成稳定的 IFN-β 响应特征。
数据来源于系统性红斑狼疮患者，基线干扰素活化背景可能影响响应幅度，因此不宜直接外推至健康人群。

#结果文件

report.md：完整分析报告和结果解读
results/processed/kang_ifnb_scored.h5ad：包含质控、注释、UMAP 和 ISG 评分的 AnnData 对象
results/isg：ISG 评分、供体配对统计和细胞类型响应矩阵
results/deg：各细胞类型的伪 bulk 差异表达表、特异性矩阵和敏感性结果
results/metadata：质量控制、注释交叉验证和 Marker 表达结果
figures：案例三全部结果图
scripts：数据构建、质控注释、ISG 分析、差异表达和作图脚本

#结果总结

本案例从 29,065 个原始细胞中获得 24,562 个高质量 singlet。IFN-β 刺激后，所有主要 PBMC 细胞类型的核心 ISG 评分均显著升高，但响应强度存在明显差异：单核细胞和 DC 最强，T 细胞相对较弱。差异表达分析进一步识别出 35 个跨细胞类型共享的上调基因，以及以单核细胞为主的大量类型特异性响应基因，说明 IFN-β 同时诱导通用干扰素程序和细胞类型依赖的转录变化。

#使用建议

先检查细胞数量、分组和 UMAP，再解读刺激响应。
比较刺激组和对照组时应保留供体配对关系，避免把个体差异误判为刺激效应。
ISG 评分用于描述整体响应强度，具体机制仍需结合差异基因和通路结果判断。
小细胞群或配对样本不足时，不应强行进行差异表达检验。
复用该流程时，应明确疾病背景、刺激剂量、刺激时间和供体数量。