CITE-seq 与单细胞多组学联合分析
CITE-seq 在单细胞转录组测序的同时，用带 DNA 条形码的抗体标记细胞表面蛋白，每个细胞得到两套数据：RNA 计数和抗体衍生标签（ADT）计数。蛋白信号对 CD4、CD8、CD45RA、CD45RO 等表面标志更直接，弥补了这些基因 mRNA 检出率低的问题，常用于免疫细胞精细分型。相关技术还有用于样本复用的 Hashtag（HTO）和同时测 RNA 与 ATAC 的 10x Multiome。分析的核心是对每种模态分别做质控和归一化，再通过加权近邻（WNN）、totalVI 或多组学因子模型把两种信息合并，用于聚类、注释和差异分析。
什么时候用
- 免疫细胞分型，需要用 CD4、CD8、CD45RA 等表面蛋白区分 RNA 上难以分开的亚群
- 样本用 Hashtag 抗体复用后上机，需要拆分样本并识别跨样本双细胞
- 希望流式细胞术定义的细胞群与转录组聚类结果对应起来
- 同一细胞测了 RNA 和 ATAC，需要联合两种模态聚类和推断调控关系
- 比较蛋白与 mRNA 表达的一致性，研究转录后调控
不适合的情况
- 抗体面板很小（只有几个抗体），蛋白模态信息不足以单独聚类，只宜作为注释辅助
- 不同样本或细胞分别测 RNA 和蛋白，属于非配对数据，需要另一类整合方法
- 用 ADT 计数绝对值比较不同批次的蛋白水平，抗体批次和染色条件差异很大
需要准备的数据
- RNA 与 ADT 计数矩阵
- Cell Ranger 多特征矩阵，基因表达与抗体捕获两类特征需分开读取
- 未过滤原始矩阵
- 包含空液滴的 raw 矩阵，dsb 用空液滴估计每个抗体的环境背景
- 抗体面板信息
- 每个抗体对应的蛋白、克隆号，以及同型对照抗体名称，用于背景校正和结果解读
- Hashtag 或多组学数据（可选）
- HTO 计数矩阵用于样本拆分；Multiome 数据需提供 ATAC fragments 文件和峰矩阵
分析步骤
- 1
读取并拆分模态
分别构建 RNA 和 ADT 两套计数，保存为同一对象的不同 assay 或 MuData 的不同模态。检查抗体名称与面板一致，确认同型对照抗体已正确识别。
- 2
样本拆分与双细胞
使用 Hashtag 时，用 HTODemux、MULTIseqDemux 或 hashsolo 等方法给每个细胞分配样本，同时识别含两个 Hashtag 的跨样本双细胞和无信号细胞。判断标准：Hashtag 计数分布应呈清楚的双峰。
- 3
双模态质控
RNA 部分按常规质控；ADT 部分查看每个细胞的 ADT 总计数和同型对照计数，异常高的同型对照信号通常表示非特异结合或细胞聚集。两种模态的质控结果都要满足才保留细胞。
- 4
ADT 归一化
常用 CLR 归一化，即对每个细胞或每个抗体做中心对数比转换；有空液滴时推荐 dsb，用空液滴估计环境背景并用同型对照去除细胞间技术噪音。判断标准：阳性和阴性群体在直方图上明显分开，阴性群中心接近 0。
- 5
单模态降维
RNA 按常规流程做高变基因和 PCA；ADT 因特征数少，通常直接用全部抗体做 PCA，或不降维直接使用。分别查看两种模态的 UMAP，了解各自能分开哪些细胞群。
- 6
多模态联合
用 Seurat 的 FindMultiModalNeighbors 构建 WNN 图，为每个细胞学习 RNA 与蛋白的权重后聚类；或用 totalVI 联合建模两种计数。Multiome 数据同样可用 WNN 联合 RNA 与 ATAC。
- 7
注释与差异分析
结合蛋白 marker 与 RNA marker 注释细胞群，蛋白信号常用于区分初始与记忆 T 细胞等亚群。比较模态权重的分布，可看出哪些细胞群主要依赖蛋白信息划分。
关键参数与决策
ADT 归一化方法
CLR 简单通用，不需要空液滴，Seurat 中设 normalization.method 为 CLR，并注意 margin 是按细胞还是按特征。dsb 需要空液滴和同型对照，背景去除更彻底，阴性群更接近 0。
同型对照的使用
同型对照反映非特异结合水平。dsb 可利用同型对照估计每个细胞的技术噪音。没有同型对照时，只能依靠空液滴或阴性群估计背景，对低丰度蛋白的判断会更困难。
WNN 输入维数
需为每种模态分别指定降维结果和维数：RNA 取 PCA 前若干维；ADT 抗体数通常只有几十个，可用的主成分也随之少得多，维数宜明显少于 RNA。维数会影响模态权重，应参考各模态的肘部图确定。
Hashtag 判定阈值
HTODemux 等方法按每个 Hashtag 的背景分布判定阳性。染色效率低或某个 Hashtag 信号弱时，会出现较多无信号细胞，应查看各 Hashtag 分布，必要时换算法比较。
常见错误
- 对 ADT 套用 RNA 的 log 归一化：ADT 背景高、特征少，按 RNA 方式归一化后阴性群不接近 0，导致阳性阴性群体难以区分。
- 忽略环境抗体背景：游离抗体在所有液滴中都能被检出，不校正时会把背景信号误读为低表达，尤其影响 CD4 等高丰度抗体。
- 只用 RNA 数据聚类后再看蛋白：会错过蛋白才能区分的亚群，如 CD45RA 与 CD45RO 定义的初始和记忆 T 细胞，应在聚类阶段就联合两种模态。
- 不同抗体面板或抗体批次的数据直接合并：抗体浓度和克隆不同，ADT 数值不可比，应只使用共有抗体并做批次处理。
- Hashtag 拆分后不去除跨样本双细胞：这些双细胞在 RNA 上可能难以识别，保留下来会形成混合表型的假亚群。
- 以 mRNA 和蛋白不一致为结论而不考虑检出率：许多表面蛋白基因 mRNA 检出率低，不一致可能只是 RNA 捕获不足。
结果怎么看
ADT 表达直方图或山脊图
每个抗体在全部细胞中的表达分布。理想情况为阴性与阳性两个分离的峰；只有一个宽峰的抗体可能染色失败或该蛋白在样本中无表达，应在注释时谨慎使用。
蛋白双变量散点图
仿照流式细胞术，以两个抗体为坐标画散点，如 CD4 对 CD8。各群体应落在对应象限，双阳性群比例异常高时提示存在双细胞或背景校正不足。
WNN UMAP 与模态权重
基于 WNN 图的 UMAP 展示联合聚类结果，可按 RNA 权重着色。权重偏向蛋白的细胞群说明它们主要靠表面蛋白区分；若所有细胞权重都偏向一种模态，检查另一模态的质控和降维设置。
Hashtag 拆分结果
按 Hashtag 判定的样本、双细胞和无信号细胞分类统计，并在热图上展示各类细胞的 Hashtag 信号。双细胞比例显著高于预期，或某个样本细胞数异常少，需复查染色和阈值。
和相近方法怎么选
CLR 与 dsb 归一化
CLR 不依赖额外信息，适合没有原始矩阵的公共数据。dsb 利用空液滴和同型对照去除背景与细胞间技术噪音，阴性群更集中在 0 附近，便于设阈值。有原始矩阵和同型对照时，推荐优先尝试 dsb。
WNN 与 totalVI
WNN 在两种模态各自降维后学习每个细胞的模态权重，构建联合近邻图，集成在 Seurat 中，易于理解。totalVI 是 scvi-tools 中的概率模型，联合建模 RNA 与蛋白计数，可估计背景和去噪，但需要训练，建议用 GPU。
配对多组学与 MOFA 等多组学因子分析
CITE-seq 和 Multiome 属于同一细胞的配对多组学，可在细胞层面直接联合。MOFA 一类方法更常用于样本层面的多组学整合，寻找跨组学的共同变异因子；两者目标和数据结构不同，可按研究问题组合使用。
常见问题
CITE-seq 的 ADT 数据怎么归一化？
最常用 CLR，Seurat 中用 NormalizeData 并设 normalization.method 为 CLR。若有包含空液滴的原始矩阵和同型对照，推荐用 dsb，它能去掉环境背景和细胞间技术噪音，让阴性群更接近 0，阈值判定更直观。
WNN 是什么，怎么用？
WNN 即加权最近邻分析，为每个细胞计算 RNA 和蛋白（或 ATAC）各自预测邻居的能力，据此给两种模态分配权重，再构建联合近邻图用于聚类和 UMAP。在 Seurat 中通过 FindMultiModalNeighbors 实现，需先为每种模态各自降维。
CITE-seq 一定要加同型对照吗？
不是必须，但建议加。同型对照用于评估非特异结合，dsb 等方法利用它去除细胞间技术噪音。没有同型对照时仍可用 CLR 归一化和空液滴背景校正，但对低丰度蛋白的阳性判定会更依赖经验。
蛋白和 RNA 表达不一致说明什么？
可能有生物学原因，如转录后调控或蛋白半衰期长；也可能是技术原因，如该基因 mRNA 检出率低、抗体非特异结合或背景未校正。下结论前应检查抗体在阳性对照细胞中的表现和 mRNA 的检出比例。
10x Multiome 的 RNA 和 ATAC 怎么联合分析？
两种模态分别质控和降维：RNA 用 PCA，ATAC 常用 TF-IDF 加 SVD（LSI），然后用 WNN 构建联合近邻图聚类。可进一步把峰与邻近基因关联，推断候选调控元件；ATAC 的峰检测与 motif 分析可参考 ATAC-seq 流程。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明抗体面板、是否用 Hashtag 或多组学数据后，会先确认归一化和联合分析方案。随后进行 CITE-seq 分析：读取 RNA 与 ADT，完成双模态质控、ADT 归一化和样本拆分；再做单细胞多组学预处理与整合，用加权近邻联合聚类和注释。交付 ADT 分布图、蛋白散点图、联合 UMAP 与模态权重、Hashtag 拆分统计、数据对象和可复现脚本。
我有一份 PBMC 的 CITE-seq 数据，约 30 个抗体含同型对照，帮我用 dsb 归一化 ADT，再用 WNN 联合聚类，区分初始和记忆 T 细胞