ATAC-seq 分析：峰检测、差异峰与 motif
ATAC-seq 利用 Tn5 转座酶优先切入开放染色质并同时加上接头，测序后读段富集的区域就是可及性高的区域，通常对应启动子、增强子等调控元件。一次实验可以回答：哪些区域开放、不同条件下哪些区域开放程度改变、这些区域富集了哪些转录因子结合基序，以及在测序足够深时哪些位点被转录因子实际占据。标准流程包括比对与过滤、质控、峰检测、构建共识峰集与计数、差异可及性分析、峰注释，以及 motif 富集和足迹分析。所需起始细胞量少，常用于比较处理前后、不同细胞类型或疾病与正常样本的调控差异。
什么时候用
- 比较处理组与对照组，找出染色质开放程度改变的调控区域
- 推断哪些转录因子驱动了某种细胞状态或分化过程
- 与 RNA-seq 联合，寻找可及性和表达同向改变的候选调控元件
- 细胞量有限、难以做 ChIP-seq 时，先整体描绘调控景观
- 为 GWAS 位点或非编码变异寻找可能所在的功能性开放区域
不适合的情况
- 想确定某个特定转录因子或组蛋白修饰的结合位置，应做 ChIP-seq 或 CUT&Tag
- 每组只有 1 个样本却要做差异可及性统计
- 测序深度较浅的数据上做单个位点的足迹分析
需要准备的数据
- 双端 FASTQ
- ATAC-seq 推荐双端测序，可获得真实片段长度；接头为 Nextera 序列，修剪时要选对。
- 参考基因组与黑名单
- 与注释一致的基因组版本，以及 ENCODE 黑名单区域文件，用于去除高信号伪影区域。
- 样本信息表
- 样本 ID、条件、重复、批次；差异分析需要每组生物学重复，常见设计为每组至少 2 到 3 个。
- 可选的 RNA-seq 结果
- 同条件的差异表达表，用于把差异峰与邻近基因的表达变化对应起来。
分析步骤
- 1
修剪与比对
用 fastp、Trim Galore 或 cutadapt 去除 Nextera 接头，再用 Bowtie2 比对，常设最大片段长度如 -X 2000，保留较长的核小体片段。比对率明显偏低时检查物种、接头和污染。
- 2
过滤读段
去除线粒体读段、低比对质量读段（常用 MAPQ 30 作为阈值）、PCR 重复和黑名单区域读段。线粒体比例高说明核膜裂解或细胞状态不佳，过滤后剩余的有效读段数决定后续能做什么。
- 3
质量评估
看片段长度分布：应有小于 100 bp 的无核小体峰和约 200 bp 间隔的核小体周期。计算 TSS 富集分数和 FRiP，ENCODE 标准中 FRiP 大于 0.3 较理想，大于 0.2 可接受。
- 4
峰检测
MACS2 callpeak 用 -f BAMPE 按真实片段检测，或按 Tn5 切点用 --nomodel --shift --extsize 方式。可逐样本检测后合并，也可汇总同组样本检测。重复间用 IDR 评估一致性。
- 5
共识峰集与计数
合并各样本峰，常保留在至少两个样本中出现的峰，得到共识峰集；用 featureCounts 或 DiffBind 的 dba.count 统计每个样本在每个峰上的读段数，形成计数矩阵。
- 6
差异可及性分析
用 DiffBind（内部调用 DESeq2 或 edgeR）或直接用 DESeq2 比较条件。先看 PCA 中样本是否按条件分开，再按 FDR 和倍数变化筛选差异峰，并检查开放和关闭方向的峰数是否大致合理。
- 7
峰注释与功能
ChIPseeker 的 annotatePeak 或 HOMER 的 annotatePeaks.pl 把峰分配到启动子、内含子、基因间区并给出最近基因，再对邻近基因做通路富集，注意远端峰的靶基因只是推测。
- 8
motif 与足迹
用 HOMER findMotifsGenome.pl 以全部共识峰为背景做差异峰的 motif 富集，或用 chromVAR 在每个样本中计算 motif 偏离度；测序足够深时用 TOBIAS 等工具做足迹分析，比较转录因子结合信号的变化。
关键参数与决策
峰检测模式
双端数据用 BAMPE 能直接利用片段，得到更准确的峰宽；关心 Tn5 切点时用 --shift 与 --extsize 以切点为中心延伸。两种方式的结果不应混合比较，全项目使用同一方式。
峰检测阈值
MACS2 默认 q 值 0.05。若后续用 IDR 评估重复一致性，通常先放宽阈值保留更多候选峰，再由 IDR 筛选；直接做差异分析时用常规阈值即可。
差异分析标准化
按峰内读段做 TMM 等标准化，隐含假设大部分峰不变；如果处理造成全局开放或关闭，这一假设不成立，可改用全库读段数标准化或引入外源 spike-in。
motif 富集背景
背景决定富集的含义。以全部共识峰为背景，找出的是差异峰相对一般开放区特有的 motif；用基因组随机序列为背景，常会得到启动子相关的 GC 偏好 motif。
Tn5 偏好校正
Tn5 切割存在序列偏好，足迹分析前需校正，TOBIAS 的 ATACorrect 即为此设计。不校正时，切割偏好本身就能形成类似足迹的凹陷，导致假阳性。
常见错误
- 不去除线粒体读段：线粒体 DNA 无核小体保护，常占读段的很大比例，会稀释有效信号并扭曲文库大小标准化。
- 合并重复后只检测一次峰再做差异：失去重复信息后无法估计生物学变异，差异峰的显著性无从谈起，应保留每个样本的计数。
- 把所有差异峰都分配给最近基因：远端增强子常调控更远的基因，最近基因只是简化假设，结论应结合表达数据或染色质互作信息。
- 在浅测序数据上解读单个位点足迹：足迹需要高覆盖才能稳定，深度不足时得到的多为噪音，应改为在 motif 整体层面比较。
- 忽视 TSS 富集低的样本：低 TSS 富集意味着信噪比差，若低质量样本集中在某一组，差异结果会主要反映质量差异而非生物学差异。
结果怎么看
片段长度分布图
横轴是片段长度，纵轴是频数。高质量数据在 100 bp 以下有尖峰，之后约每 200 bp 出现递减的小峰。若周期性完全消失或只剩长片段，提示 Tn5 切割过度或不足。
TSS 富集图与热图
以转录起始位点为中心统计信号，曲线中央应有明显尖峰。deepTools 的 plotHeatmap 可同时比较多个样本，若某样本中心峰明显低平，应考虑剔除或降低其权重。
差异峰火山图与 MA 图
每个点是一个峰，横轴为倍数变化，纵轴为显著性或平均信号。看差异峰是否在两个方向都存在；若几乎全部朝同一方向偏移，先检查标准化是否适合存在全局变化的数据。
motif 富集结果表
列出每个 motif 的富集 P 值、目标与背景中出现比例。同一家族的 motif 常一起出现，难以区分具体成员，应结合该家族成员的表达量判断哪个转录因子更可能起作用。
足迹差异图
以 motif 为中心的平均切割信号，结合位点中央出现凹陷、两侧升高。比较两组的足迹深度变化，并配合差异结合散点图查看哪些转录因子的结合信号整体改变。
和相近方法怎么选
ATAC-seq 与 ChIP-seq / CUT&Tag
ATAC-seq 无需抗体，一次实验覆盖所有开放区域，但无法告诉你是哪个蛋白结合；ChIP-seq 和 CUT&Tag 针对特定转录因子或组蛋白修饰，特异性强，依赖抗体质量。常见路径是先用 ATAC-seq 找候选转录因子，再用 CUT&Tag 验证。
HOMER 富集与 chromVAR
HOMER 对一组峰做 motif 富集，回答差异峰中哪些 motif 过多；chromVAR 为每个样本或细胞计算 motif 相关可及性的偏离度，适合多样本比较和单细胞 ATAC。两者结论一致时更可信。
bulk ATAC-seq 与单细胞 ATAC-seq
bulk 数据深度高，适合差异峰统计和足迹分析，但反映的是细胞群体平均；单细胞 ATAC 可区分细胞类型各自的调控景观，但每个细胞数据极稀疏，通常需要按细胞群汇总后再做峰水平分析。
常见问题
ATAC-seq 数据质量怎么判断？
主要看四项：过滤后的有效读段数、片段长度分布是否有核小体周期、TSS 富集分数和 FRiP。ENCODE 对 FRiP 的建议是大于 0.3 较理想，大于 0.2 可接受；TSS 富集的阈值与参考注释有关，可参考 ENCODE 标准。
MACS2 做 ATAC-seq 用什么参数？
双端数据常用 -f BAMPE 并关闭模型构建；也可以用 --nomodel --shift -100 --extsize 200 以切点为中心检测。通常加 --keep-dup all，因为去重已在前面完成。阈值一般用默认 q 值 0.05，配合 IDR 时可放宽。
差异峰很少怎么办？
先看 PCA 中同组样本是否聚在一起，若重复间差异大于组间差异，差异峰自然少；再检查是否有低质量样本拉低了统计功效，以及共识峰集是否合理。确实变化小时可以在 motif 层面用 chromVAR 比较，灵敏度往往更高。
ATAC-seq 需要 input 对照吗？
通常不需要。ATAC-seq 本身测的是可及性，不存在 ChIP 意义上的免疫沉淀背景，峰检测时以局部背景估计噪音。需要注意的是黑名单区域和线粒体读段，它们是 ATAC-seq 主要的背景来源。
足迹分析需要多深的测序？
足迹分析对深度的要求明显高于峰检测和差异分析，具体取决于基因组大小和转录因子。常见做法是合并同组重复以提高覆盖，并在 motif 整体层面比较，而不是解读单个位点。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明 FASTQ 或比对文件的位置、物种和基因组版本，以及分组设计。Codar 会先确认方案，包括过滤标准、峰检测方式、差异分析的比较组和 motif 背景，然后运行 ATAC-seq 染色质可及性分析以及转录因子基序与足迹分析，交付质控图、峰集与差异峰表、火山图、峰注释、motif 富集和足迹结果，以及分析报告和可复现脚本。
我有 6 个人 T 细胞 ATAC-seq 样本（刺激组和静息组各 3 个，双端 FASTQ），想找出差异开放区域和可能驱动激活的转录因子。