ChIP-seq 与 CUT&Tag 分析流程
ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 都用抗体识别某种组蛋白修饰或 DNA 结合蛋白，再测序其所在的 DNA 片段，从而得到全基因组的结合或修饰分布。ChIP-seq 先交联、超声打断再免疫沉淀，背景较高，需要 input 对照和较多细胞；CUT&RUN 和 CUT&Tag 在原位用抗体引导酶切或 Tn5 插入，背景低，所需细胞和测序量都更少。常见对象包括 H3K4me3（启动子）、H3K27ac（活跃启动子与增强子）、H3K4me1（增强子）、H3K27me3 与 H3K9me3（抑制性、常呈宽峰）。分析流程包括比对与过滤、质控、峰检测、差异结合、峰注释以及与表达数据的整合。
什么时候用
- 比较处理前后某组蛋白修饰在启动子或增强子上的变化，如 H3K27ac
- 敲除或抑制表观修饰酶后，评估 H3K27me3 等修饰的全基因组改变
- 鉴定活跃增强子和超级增强子，寻找驱动细胞身份的调控区
- 细胞量少（如原代分选细胞）时，用 CUT&Tag 获取修饰图谱
- 与 RNA-seq 联合，判断差异基因的启动子修饰是否同向变化
不适合的情况
- 抗体未经验证或特异性差，任何分析流程都无法挽救
- 想无偏地了解哪些区域开放而不针对特定蛋白，更适合 ATAC-seq
- 处理引起修饰整体增减却没有 spike-in，常规标准化无法正确反映
需要准备的数据
- FASTQ 文件
- ChIP-seq 单端或双端均可，CUT&RUN 和 CUT&Tag 推荐双端测序以获得准确片段长度。
- 对照样本
- ChIP-seq 需配套 input；CUT&Tag 和 CUT&RUN 常设 IgG 对照，背景极低时也可不用对照检测峰。
- spike-in 信息
- 外源染色质（如果蝇）或酶制剂残留的大肠杆菌 DNA，用于全局变化时的标准化，需比对到对应基因组统计。
- 样本信息表
- 抗体、条件、生物学重复和批次；差异结合分析需要每组有生物学重复。
分析步骤
- 1
比对与过滤
用 Bowtie2 比对到参考基因组，过滤低比对质量读段和黑名单区域。ChIP-seq 常规去除 PCR 重复；CUT&Tag 的 Tn5 插入有偏好，真实片段重复概率更高，是否去重需结合重复率和对照判断。
- 2
统计 spike-in
把读段同时比对到外源基因组，统计 spike-in 读段比例并计算缩放因子。各样本 spike-in 比例差异很大时，需先确认加入量是否一致，再决定是否用于标准化。
- 3
质量评估
用 deepTools 的 plotFingerprint 看富集程度，富集好的样本曲线明显偏离对角线；用 plotCorrelation 看重复一致性；查看已知靶区（如管家基因启动子对应 H3K4me3）是否有信号。
- 4
峰检测
尖锐的修饰和转录因子用 MACS2 窄峰模式；H3K27me3、H3K9me3、H3K36me3 等宽域修饰用 --broad 或 SICER、epic2 等宽峰工具。CUT&Tag 和 CUT&RUN 可用 SEACR，结合 IgG 对照或取信号最高的一部分区域。
- 5
构建共识区域
合并各样本的峰形成共识区域，或对宽域修饰改用固定窗口；统计每个样本在每个区域的读段数。宽峰修饰在基因组上大片分布，固定窗口往往比峰更适合差异分析。
- 6
差异结合分析
用 DiffBind、csaw 或直接用 DESeq2、edgeR 比较条件。先看样本 PCA 是否按条件分开，再筛选差异区域。存在全局变化时使用 spike-in 缩放因子，并在报告中注明标准化方式。
- 7
注释与可视化
用 ChIPseeker 注释峰在启动子、基因体和基因间区的分布；用 deepTools 的 computeMatrix 和 plotHeatmap 绘制 TSS 或差异区域周围的信号热图；在 IGV 中检查代表性位点。
- 8
整合表达数据
把差异修饰区域按启动子或邻近基因与 RNA-seq 差异基因对应，检查方向是否一致，例如 H3K27ac 增加的区域邻近基因是否上调。H3K27ac 数据还可用 ROSE 等方法识别超级增强子。
关键参数与决策
窄峰与宽峰模式
依据修饰本身的分布选择，而非看结果多少。用窄峰模式检测 H3K27me3 会把一个大的修饰域切成大量碎片峰，用宽峰模式检测 H3K4me3 则会把相邻启动子合并。
SEACR 阈值模式
有 IgG 对照时用对照确定阈值；无对照时给出数值，表示取信号最高的一部分区域，例如 0.01。stringent 模式更保守，relaxed 模式召回更多但假阳性也更多。
是否去重
ChIP-seq 中 PCR 重复会虚增信号，通常去除；CUT&Tag 背景低、文库复杂度有限，部分重复来自真实的相同插入位点。可同时保留两套结果，比较峰数和差异结论的稳定性。
标准化方式
常规按文库大小或峰内读段标准化，前提是大部分区域不变。抑制 EZH2 导致 H3K27me3 整体下降时，这类方法会把真实的全局下降抹平，应改用 spike-in 缩放。
片段长度过滤
CUT&RUN 中较短片段更多反映转录因子结合，较长片段更多反映核小体，组蛋白修饰数据可保留核小体大小的片段。按片段长度分开分析有助于提高特异性。
常见错误
- 宽域修饰用窄峰模式检测：H3K27me3 被切成成千上万个小峰，峰数和峰宽都失真，后续的差异分析和注释比例也随之失真。
- 没有对照就用 MACS2 检测 ChIP-seq：开放染色质和高拷贝区域在没有 input 时会被当作富集信号，产生大量假阳性峰。
- 全局修饰变化时仍按文库大小标准化：真实的整体下降会被校正掉，甚至出现部分区域假性上升，结论方向可能完全错误。
- CUT&Tag 结果只看峰数而不检查开放区偏好：Tn5 倾向切入开放染色质，抗体信号弱时峰会集中在可及区域，看起来像活跃修饰。
- 单个重复下差异结合结论：没有生物学重复无法估计变异，差异区域的显著性不可信，只能作为描述性的初步观察。
结果怎么看
指纹图
横轴为按覆盖度排序的基因组区间，纵轴为累积读段比例。input 接近对角线，富集好的样本在末端急剧上升。若 IP 样本曲线与 input 几乎重合，说明富集失败，不宜继续分析。
TSS 或峰中心信号热图
每行是一个区域，按信号强度排序。H3K4me3 应在 TSS 处呈集中信号，H3K27me3 呈较宽的分布。比较组间热图可直观看到整体变化，但要确认用的是同一种标准化。
峰注释分布图
柱状图或饼图显示峰位于启动子、内含子、基因间区的比例。H3K4me3 大部分应位于启动子；若一个启动子修饰的峰大量落在基因间区，提示抗体特异性或峰检测参数有问题。
差异结合结果表与火山图
列出每个区域的倍数变化、P 值、FDR 和邻近基因。看差异区域的方向分布是否与实验预期一致，并在 IGV 中抽查若干最显著区域，确认是连续的信号改变而非个别尖峰。
和相近方法怎么选
ChIP-seq 与 CUT&Tag
ChIP-seq 方法成熟、公共数据多，适用于大多数抗体，但需大量细胞和 input 对照；CUT&Tag 起始量低、背景低、测序量少，适合稀有细胞，但对抗体要求更严格，且 Tn5 有开放区偏好。新项目细胞有限时常选 CUT&Tag。
CUT&RUN 与 CUT&Tag
两者都在原位定向切割。CUT&RUN 用 MNase 释放片段后再建库，适用范围较广，转录因子数据常用；CUT&Tag 用 Tn5 直接插入接头，流程更短、背景更低，组蛋白修饰效果通常更好。
MACS2 与 SEACR
MACS2 基于局部背景的统计模型，设计初衷是有一定背景的 ChIP-seq；SEACR 针对 CUT&RUN 和 CUT&Tag 背景几乎为零的特点，用信号区块和阈值划定峰。低背景数据用 SEACR 往往更合适，ChIP-seq 仍以 MACS2 为主。
常见问题
组蛋白 ChIP-seq 用 narrow 还是 broad peak？
看修饰的生物学分布。H3K4me3 和多数 H3K27ac 信号集中，用窄峰；H3K27me3、H3K9me3、H3K36me3 覆盖大段区域，用 MACS2 的 --broad 或宽峰专用工具。不确定时先在 IGV 中观察典型位点的信号形态。
CUT&Tag 需要 IgG 对照吗？
强烈建议设置。CUT&Tag 背景本身很低，没有对照也能检测峰，但 IgG 对照可以揭示 Tn5 在开放区的非特异插入。用 SEACR 时有对照可直接据此设阈值，无对照时只能按信号排名截取。
CUT&Tag 要测多少数据？
由于背景低，CUT&Tag 所需读段数通常远少于 ChIP-seq，经验上每个样本几百万对读段常已足够检测组蛋白修饰。宽域修饰和需要做差异分析时可适当增加，并以重复间相关性和峰数饱和度判断是否够用。
什么时候需要 spike-in？
当处理可能导致修饰整体水平改变时，例如抑制 EZH2 或 HDAC、敲除修饰酶。此时按文库大小或峰内读段标准化会抹平全局变化，只有 spike-in 能提供外部参照。整体水平不变的比较可不用。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明 FASTQ 或比对文件位置、目标修饰或抗体、对照与 spike-in 设计以及分组。Codar 会先确认方案，包括窄峰或宽峰的选择、对照和标准化方式、比较哪些条件，然后运行组蛋白 ChIP-seq 分析或 CUT&RUN 与 CUT&Tag 分析，交付质控图、峰集与注释、信号热图、差异结合区域表，以及分析报告和可复现脚本。
我做了 EZH2 抑制剂处理前后的 H3K27me3 CUT&Tag，每组 3 个重复，带 IgG 和大肠杆菌 spike-in，想看 H3K27me3 在哪些基因上减少。