DNA 甲基化分析：甲基化芯片与差异甲基化区域
DNA 甲基化主要指 CpG 中胞嘧啶第 5 位碳的甲基修饰，参与基因表达调控、基因组印记和肿瘤发生。人群研究最常用 Illumina 450K、EPIC（850K）芯片，每个探针测得甲基化与非甲基化信号，换算为 0 到 1 的 Beta 值；RRBS、WGBS 等测序路线则按 reads 中 C 与 T 的比例推算每个 CpG 的甲基化水平。分析分两层：逐位点差异（DMP），以及多个相邻 CpG 一致变化构成的差异甲基化区域（DMR）。DMR 更稳健，也更容易对应到启动子等调控元件。
什么时候用
- 病例对照或处理前后比较，寻找与疾病、暴露相关的差异甲基化位点
- 表观基因组关联研究（EWAS），关联吸烟、BMI 等表型与血液甲基化
- 肿瘤与癌旁组织比较，寻找启动子高甲基化而沉默的抑癌基因
- 整合表达数据，筛选甲基化与表达负相关的候选调控基因
- RRBS 或 WGBS 数据中识别跨多个 CpG 的差异甲基化区域
- 对 GEO 已发表的 450K、EPIC 数据做再分析或独立验证
不适合的情况
- 只有处理后的 Beta 矩阵、没有检测 P 值时，无法规范过滤探针，结论需降级表述
- 组间细胞组成差异巨大又无法估计时，差异多半反映细胞比例而非甲基化本身
- 研究 5hmC：常规亚硫酸氢盐处理不区分 5mC 与 5hmC，需要 oxBS 等专门方法
需要准备的数据
- IDAT 原始文件
- 每个样本红、绿两通道的 .idat 文件，配合含 Sentrix ID 和孔位的样本表；不要只用厂商导出的 Beta 值
- 样本信息表
- 分组、年龄、性别、芯片编号、孔位和处理批次；记录性别用于和芯片推断性别核对
- 亚硫酸氢盐测序 FASTQ
- RRBS 或 WGBS 的 reads，需说明建库是否为定向文库、RRBS 是否 MspI 酶切，影响比对和末端修剪
- 参考基因组与注释
- 与芯片 manifest 或比对一致的版本（hg19 或 hg38），用于把位点注释到启动子、CpG 岛等区域
- 细胞组成参考（可选）
- 血液可用 FlowSorted 系列参考数据，其他组织需要对应的纯化细胞甲基化参考谱
分析步骤
- 1
读入与样本质控
用 minfi 的 read.metharray.exp 或 ChAMP 的 champ.load 读入 IDAT，计算检测 P 值。检测失败探针比例明显偏高的样本应剔除；用芯片预测性别核对记录性别，不一致提示样本混淆。
- 2
探针过滤
去掉检测 P 值大于 0.01、beadcount 不足、含常见 SNP 和交叉杂交的探针；男女混合时通常去掉性染色体探针。记录每一步剩余探针数，便于在方法部分如实报告。
- 3
标准化
芯片同时有 Type I 和 Type II 两种探针，Beta 分布不同，需要用 BMIQ、SWAN、Funnorm 或 Noob 等方法校正。标准化后看密度图，两类探针的双峰应基本对齐。
- 4
批次与细胞组成
用 SVD 或 PCA 检查主成分与芯片编号、孔位、分组的关联；血液样本用参考库估计各类细胞比例，作为协变量放进模型。批次与分组完全混杂时无法在事后校正。
- 5
差异甲基化位点
用 M 值做 limma 线性模型，设计矩阵包含分组以及年龄、性别、细胞比例等协变量，得到每个 CpG 的效应、P 值和 FDR；同时报告组间 Beta 均值差（Δβ）便于理解效应大小。
- 6
差异甲基化区域
基于位点统计量用 DMRcate、bumphunter 或 ProbeLasso 合并相邻显著 CpG，输出区域坐标、CpG 数、平均 Δβ 和区域显著性。通常要求区域内至少两个 CpG 且变化方向一致。
- 7
测序数据路线
RRBS 或 WGBS 用 Bismark 比对并提取甲基化，先检查亚硫酸氢盐转化效率（非 CpG 甲基化率应很低），再按覆盖深度过滤 CpG，用 methylKit 或 DSS 检验差异位点和区域。
- 8
注释与功能解读
把 DMR 注释到启动子、CpG 岛及其两侧 shore、基因体，再做通路富集；有配对表达数据时，检验启动子甲基化与基因表达是否呈负相关，作为调控关系的佐证。
关键参数与决策
Beta 值还是 M 值
M 值是甲基化与非甲基化信号比值取 log2，在接近 0 和 1 的两端方差更稳定，适合统计检验；Beta 值直观，适合报告和作图。常见做法是用 M 值检验、用 Δβ 报告效应。
标准化方法
minfi 文档指出，组间整体甲基化差异大（如肿瘤对正常）时，quantile 类方法可能抹掉真实差异，Funnorm 更合适；同质组织的人群样本中 quantile 也常用。同一研究内只用一种方法。
Δβ 阈值
常用 0.05 到 0.2。血液 EWAS 的效应往往只有几个百分点，阈值过高会丢掉可复现的信号；肿瘤研究可用 0.2。阈值应与 FDR 联合使用，不要只按 Δβ 排序筛选。
细胞组成协变量
血液用 Houseman 参考法估计中性粒细胞、淋巴细胞等比例。没有参考库的组织可用无参考方法或替代变量分析（SVA），但这类方法可能吸收一部分真实的生物学差异。
DMR 合并参数
DMRcate 的 lambda（核带宽，默认 1000 bp）和 C 控制多远的 CpG 被合并；bumphunter 的 cutoff 和置换次数影响区域数量与 P 值稳定性。调参后核对区域数。
测序覆盖阈值
methylKit 常用 filterByCoverage 去掉覆盖低于 10x 的 CpG，并去掉覆盖极高的位点（如超过 99.9 百分位）以排除 PCR 偏倚。样本少时阈值过高会丢失大量位点。
常见错误
- 用 Beta 值直接做 t 检验：Beta 值在 0 和 1 附近方差被压缩，高、低甲基化位点的显著性不可比，结果偏向中间甲基化区域。
- 血液样本不做细胞组成校正：炎症、吸烟等会改变中性粒细胞比例，找到的差异位点很可能只是细胞类型特异的甲基化标记。
- 病例和对照分别放在不同芯片上：批次与分组完全混杂，ComBat 等校正会连同真实差异一起去除或制造假阳性，应在实验设计时随机排布。
- 保留含 SNP 和交叉杂交的探针：这类探针受遗传背景影响呈三峰分布，常被误判为差异甲基化，在不同人群中难以复现。
- 混用 hg19 与 hg38 注释：450K、EPIC 的 manifest 存在不同基因组版本，坐标版本不一致会把 DMR 注释到错误的基因或区域。
- 忽视亚硫酸氢盐转化不完全：未转化的 C 被读成甲基化，整体甲基化水平偏高，应看非 CpG 甲基化率或 lambda DNA 掺入对照。
结果怎么看
Beta 值密度图
每个样本的 Beta 分布应在 0 和 1 附近呈双峰。某个样本峰形明显偏移或中间值过多，提示 DNA 质量差、转化不完全或样本污染，应考虑剔除后重新标准化。
SVD 或 PCA 关联热图
展示前几个主成分与分组、芯片编号、孔位、细胞比例的关联强度。如果第一主成分主要由芯片编号驱动，说明批次效应强于生物信号，需要先处理批次再做差异分析。
DMP 表、火山图与 QQ 图
列出每个 CpG 的 Δβ、M 值效应、P 值、FDR 和注释。QQ 图的基因组膨胀系数明显大于 1 提示残余混杂；显著位点集中在某些探针类型或 SNP 附近时，回头检查过滤。
DMR 表与区域图
表中列出区域坐标、CpG 数、平均 Δβ、FDR 和最近基因。区域图把每个 CpG 的 Beta 值按组画在基因结构上，用来确认变化在相邻 CpG 上一致，而不是被单个离群点带动。
甲基化与表达关联图
启动子 DMR 平均 Beta 与对应基因表达的散点图。启动子高甲基化伴随低表达更支持调控关系；基因体甲基化与表达常呈正相关，不能套用同一解释。
和相近方法怎么选
甲基化芯片与 RRBS、WGBS
芯片成本低、流程标准，适合几百到上千样本的人群研究，但只覆盖预设 CpG。WGBS 覆盖几乎全部 CpG，测序成本高；RRBS 富集 CpG 岛区域，成本居中。样本多选芯片，探索未知区域选测序。
ChAMP 与 minfi
ChAMP 把读入、过滤、BMIQ 标准化、批次检查、DMP、DMR 和细胞组成估计封装成一组函数，适合快速完成标准流程；minfi 更底层，标准化方法选择更多，适合逐步自定义。两者的对象可以衔接使用。
DMP 与 DMR
DMP 逐个 CpG 检验，分辨率高，但多重检验负担重、单个探针易受噪声影响；DMR 汇总相邻 CpG，功能解释更清楚。常见做法是先跑 DMP 再识别 DMR，以 DMR 作为主要结论。
差异甲基化分析与表观遗传时钟
差异分析回答哪些位点在组间不同，能定位到具体基因；表观遗传时钟用固定的 CpG 组合得到一个年龄分数，回答样本整体衰老程度。两者可共用同一套预处理结果。
常见问题
450K 和 EPIC 芯片数据能合并分析吗？
可以。大部分 450K 探针在 EPIC 上保留，取两者共有探针合并，并把平台作为批次变量处理。minfi 的 combineArrays 能把两类对象合并为一个虚拟芯片。合并后用 PCA 确认平台差异已被控制，再做差异分析。
Δβ 多大才算有意义的甲基化差异？
没有统一标准。肿瘤与正常组织之间常见 0.2 以上的差异；血液 EWAS 中与吸烟、BMI 相关的位点 Δβ 常只有百分之几，但在大样本中能稳定复现。建议同时报告 FDR 和 Δβ，并尽量在独立队列验证。
甲基化芯片研究需要多少样本？
取决于效应大小，没有硬性门槛。肿瘤对正常、不同组织之间这类大效应比较，每组十几个样本就可能找到稳健区域；人群 EWAS 效应很小，通常需要数百样本。小样本研究应以 DMR 和功能富集为主，不过度解读单个位点。
只有 GEO 上的 Beta 矩阵还能分析吗？
能做，但受限。没有 IDAT 就无法重新计算检测 P 值，也做不了 Noob 等背景校正，只能对现有矩阵做探针过滤、BMIQ 和下游统计。先读原文方法确认作者是否已标准化，避免重复标准化。
甲基化芯片的 SNP 探针要不要去掉？
一般建议去掉探针序列或目标 CpG 上含常见 SNP 的探针，以及文献报道的交叉杂交探针。ChAMP 的 champ.filter 和 minfi 的 dropLociWithSnps 都能完成。若研究等位特异性甲基化，则需要单独保留这类位点分析。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式里说明样本分组和数据来源，Codar 会先确认方案，再读取本地 IDAT 或下载公开数据，完成探针过滤、标准化和细胞组成校正，检验差异位点并识别差异甲基化区域；RRBS、WGBS 数据则从比对和甲基化提取开始。交付质控图、DMR 表与区域图、分析报告和可复现脚本。
我有 48 份全血 EPIC 芯片 IDAT，病例对照各半，想校正细胞比例、年龄和性别后找差异甲基化区域，并注释到启动子。