多组学整合分析：MOFA 与 DIABLO
多组学整合分析把同一批样本的转录组、蛋白组、代谢组、甲基化等数据放在一起建模，寻找跨组学共享或某一组学特有的变异来源。MOFA（Multi-Omics Factor Analysis）是无监督方法，把多个组学矩阵分解为少数潜在因子，并给出每个因子在各组学中解释的方差。DIABLO 来自 R 包 mixOmics，是有监督的多块稀疏判别分析，以已知分组为目标，选出区分组别且彼此相关的跨组学特征。MOFA 可容忍部分样本缺失某种组学，DIABLO 需要完整配对。
什么时候用
- 同一批样本测了两种及以上组学，想找出主要的变异来源
- 想知道某个变异轴由哪种组学驱动，或是否在多个组学中共享
- 有明确分组，想选出跨组学的联合判别特征组合
- 部分样本缺少某种组学数据，仍希望利用全部样本建模
- 把分子层面的因子与表型、批次等协变量关联，解释样本异质性
不适合的情况
- 不同组学来自不同样本且无法配对，应改为通路或基因层面的结果整合
- 每组只有几个样本却用 DIABLO 挑选特征，极易过拟合
- 单一组学已足以回答问题时，强行整合只会增加复杂度
需要准备的数据
- 各组学矩阵
- 各自完成标准化、log 转换和缺失值处理；样本 ID 在所有组学间统一
- 特征筛选结果
- 每个组学保留高变特征，数量级尽量接近，避免特征多的组学主导模型
- 样本信息
- 分组、批次、性别等协变量；DIABLO 必须有分组标签，MOFA 用于事后解释
- 样本缺失情况
- MOFA 允许部分样本缺整块组学；DIABLO 需要所有组学样本一致
分析步骤
- 1
设计整合方案
先明确目标：探索主要变异来源选 MOFA，区分已知分组并挑特征选 DIABLO。同时盘点每个样本有哪些组学、各组学样本量和特征数，判断数据能否满足方法要求。
- 2
单组学预处理
每种组学按各自惯例处理：RNA-seq 用 vst 或 log CPM，蛋白组和代谢组做 log 转换与缺失值处理，甲基化芯片常用 M 值。批次先在各组学内部检查和处理。
- 3
特征选择与平衡
按方差在每个组学中选出高变特征，常各取数百到数千个，使各组学特征数量级相近。特征过多的组学在 MOFA 中会占据更多解释方差，掩盖其他组学的信号。
- 4
训练 MOFA 模型
用 MOFA2 创建对象、设置数据和模型选项后训练。检查是否收敛，去掉几乎不解释方差的因子；必要时换随机种子重复训练，确认主要因子能稳定出现。
- 5
解读 MOFA 因子
先看方差分解图确定每个因子由哪些组学驱动，再把因子值与分组、协变量做相关，最后对高载荷特征做富集分析，为因子赋予生物学含义。
- 6
构建 DIABLO 模型
用 mixOmics 的 block.splsda 设定设计矩阵和成分数，用 tune.block.splsda 通过交叉验证确定每个组学保留的特征数 keepX，再用 perf 评估分类错误率。
- 7
评估与可视化
用 plotIndiv 看样本分离，用 circosPlot 和 cimDiablo 展示跨组学特征相关。条件允许时在独立样本中检验所选特征；交叉验证错误率低得反常时，要警惕过拟合。
关键参数与决策
MOFA 因子数
初始因子数常设 10–15，训练中会剔除解释方差很小的因子。因子过多会把噪声拆成许多小因子，过少则会把不同的生物学过程混进同一因子。
似然函数
MOFA 对连续数据用 gaussian，二值数据用 bernoulli，计数数据用 poisson。多数经过 log 转换的组学数据使用 gaussian，前提是分布近似正态。
scale_views
让各组学的总方差处于同一尺度。不同组学方差量级差别很大时建议开启，否则方差大的组学会主导因子；量级相近时可保持关闭。
DIABLO 设计矩阵
取值 0–1，表示模型对组学间相关的重视程度。值高更强调组学一致性，值低更强调分类效果；mixOmics 教程常用 0.1 左右在两者间折中。
keepX 与 ncomp
keepX 是每个成分在各组学中保留的特征数，ncomp 是成分数，两者都应通过交叉验证确定。手动设得过大，模型会选入大量与分组无关的特征。
交叉验证方案
tune 和 perf 中常用 M 折交叉验证并多次重复。样本少时折数不宜过多，重复次数要足够，报告平均错误率及其波动范围。
常见错误
- 各组学特征数量悬殊却不做平衡：特征多的组学主导潜在因子，方差分解图上看起来只有一种组学重要。
- 不在单组学内处理批次：若批次同时影响多个组学，MOFA 会把它识别为解释方差最大的因子，被误读为生物学信号。
- DIABLO 用全部样本选特征后再报告分类效果：特征选择和评估使用同一批数据，错误率被严重低估。
- 样本 ID 在不同组学间不一致或顺序错位：模型照样能运行，但学到的是错配的关系，结果没有意义。
- 直接把 MOFA 因子命名为某种生物学过程：因子是数据驱动的变异轴，可能与多个协变量相关，应先检查相关再命名。
结果怎么看
方差分解图
展示每个因子在各组学中解释的方差比例。只在一个组学中有方差的因子代表组学特异变异，多个组学都有的代表共享信号；若第一个因子主要与批次相关，说明预处理不足。
因子散点图与协变量关联
用因子值给样本作图并按分组着色，或用热图把因子与协变量对应。能清楚区分分组的因子最值得深挖；与测序深度等技术变量相关的因子应单独标注。
特征载荷图
展示每个因子在各组学中权重最大的特征。高载荷特征在生物学上应相互关联，可对其做富集；若载荷集中在少数离群特征上，需回查原始数据。
DIABLO 样本图与 circos 图
plotIndiv 显示各组学成分空间中样本的分离程度；circosPlot 显示被选特征之间的跨组学强相关。样本分离很好但交叉验证错误率高，提示模型过拟合。
和相近方法怎么选
MOFA 与 DIABLO
MOFA 无监督，不使用分组标签，回答数据中有哪些变异来源；DIABLO 有监督，以分组为目标选出判别特征。探索阶段用 MOFA，有明确分组且需要特征组合时用 DIABLO，两者可先后使用。
整合建模与逐个组学分析
逐个组学做差异分析后在通路层面取交集，简单直观，但看不到跨组学的协同变化；整合模型能直接发现共享的变异轴，但要求样本配对，对预处理也更加敏感。
MOFA 与 WGCNA
WGCNA 在单一组学内构建共表达模块；MOFA 跨组学寻找潜在因子。只有转录组时用 WGCNA 更直接，多组学配对数据时 MOFA 能区分共享信号和组学特异信号。
常见问题
多组学整合分析该选哪种方法？
取决于是否有明确分组以及样本能否配对。只想看数据结构，选无监督的 MOFA；想区分已知组别并挑选特征，选 DIABLO；样本无法配对时，改为在通路或基因层面比较各组学的分析结果。
MOFA 的因子怎么解释？
先看方差分解确定因子主要来自哪些组学，再把因子与分组和协变量做相关，最后查看高载荷特征并做富集分析。三方面信息相互一致时，才适合为因子赋予生物学名称。
DIABLO 需要多少样本？
没有固定门槛，但样本少时交叉验证不稳定，选出的特征难以重现。每组样本越多越好，应通过重复交叉验证报告错误率的波动，条件允许时保留独立验证集。
部分样本缺少某种组学怎么办？
MOFA 可以直接纳入缺少整块组学的样本，用其他组学的信息推断这些样本的因子值；DIABLO 要求完整配对，只能使用所有组学都有数据的样本，或先对缺失部分做插补。
多组学数据需要先做标准化吗？
需要，而且要在每个组学内部按其数据特性分别处理，例如转录组用 vst，代谢组做 log 转换和缩放，甲基化用 M 值。整合模型不会替你修正分布偏斜和批次差异。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中，上传各组学矩阵和样本信息并说明研究目标，Codar 会先做多组学整合方案设计，核对样本配对、特征数量和预处理方式；再按问题训练 MOFA 因子模型解读主要变异来源，或用 DIABLO 构建监督模型并交叉验证选特征。交付方差分解图、因子关联图、载荷表、DIABLO 图、报告和脚本。
我有 60 例结直肠癌组织的转录组、甲基化芯片和蛋白组数据，想先用 MOFA 看主要变异来源，再按分子分型用 DIABLO 找跨组学特征。