DIA 蛋白质组分析与差异蛋白
DIA（数据非依赖采集）是一种液相色谱-质谱采集策略：质谱按预设 m/z 窗口依次把窗口内所有前体离子一起碎裂，而不像 DDA 只挑选最强的前体。因此样本间缺失值少、定量重复性好，适合几十到数百例的队列；代价是谱图高度混合，需借助谱图库或预测谱图解析。常用软件有 DIA-NN、Spectronaut 等。分析从原始质谱文件出发，经过鉴定与 FDR 控制、蛋白定量、质控、缺失值处理和统计检验，得到差异蛋白列表。典型样本为组织、细胞、血浆和体液。
什么时候用
- 比较处理组和对照组的蛋白表达差异，样本量从几例到数百例
- 血浆或组织蛋白组队列研究，寻找候选标志物
- 转录组结果需要在蛋白层面确认，或研究 mRNA 与蛋白不一致的调控
- 已有 DDA 数据缺失值过多，希望改用 DIA 提高可重复性
- 为转录组、代谢组整合准备定量蛋白矩阵
不适合的情况
- 磷酸化等修饰位点分析：需要位点定位评估和专门流程，见翻译后修饰页
- TMT 等同重标记数据：属于另一套定量逻辑，归一化和比率压缩问题不同
- 需要绝对浓度：DIA 无标定量给出相对丰度，绝对定量需内标或靶向方法
需要准备的数据
- 原始质谱文件
- 如 Thermo .raw、Bruker .d，或转换后的 mzML；记录仪器型号、梯度长度和 DIA 窗口设置
- 蛋白序列库
- 对应物种的 UniProt FASTA，建议加入常见污染蛋白序列；与谱图库或预测库使用同一版本
- 谱图库（可选）
- DDA 建库或项目特异库；不提供时 DIA-NN 可从 FASTA 预测生成谱图库
- 样本信息表
- 文件名与样本、分组、批次、上机顺序的对应关系，上机顺序用于发现信号漂移
分析步骤
- 1
肽段与蛋白鉴定
用 DIA-NN 等软件检索，在前体和蛋白组层面控制 FDR（常用 1%）。可用 library-free 模式从 FASTA 预测谱库，或使用实验谱库。设置酶切规则、漏切数、半胱氨酸烷基化等固定修饰和可变修饰。
- 2
样本层面质控
统计每个样本鉴定到的前体数和蛋白组数，以及保留时间偏移和质量误差。某个样本鉴定数显著偏低时，先查上机记录和色谱图，再决定是否剔除并在报告中说明。
- 3
蛋白水平定量
用 MaxLFQ 等方法把肽段强度汇总为蛋白组强度，DIA-NN 的 pg_matrix 即为蛋白组矩阵。去除污染蛋白和反库条目后取 log2，作为后续分析的输入。
- 4
检查并标准化
看 log2 强度箱线图，各样本中位数应接近，不接近时做中位数标准化。DIA-NN 默认已做与保留时间相关的归一化，二次标准化前先看分布，避免重复校正造成偏差。
- 5
过滤与缺失值处理
保留在至少一组中检出比例达到阈值的蛋白，再判断缺失原因：低丰度造成的缺失用左删失方法插补，零星随机缺失可用 KNN 或不插补。记录每个蛋白各组的实际检出数。
- 6
差异分析
在 log2 强度上用 limma 拟合分组与批次，得到 log2FC、P 值和 BH 校正后的 adj.P.Val。样本量小时，limma 的经验贝叶斯方差收缩比逐个蛋白做普通 t 检验更稳定。
- 7
可视化与功能分析
绘制 PCA、火山图和差异蛋白热图；对差异蛋白做 GO、KEGG 富集或 PPI 网络分析。富集背景应设为本实验鉴定到的全部蛋白，而不是全基因组。
关键参数与决策
FDR 控制层级
通常在前体和蛋白组两个层面都控制 1%。只控制前体 FDR 时，大样本合并后蛋白层面的假阳性会累积。DIA-NN 报告中 Q.Value、PG.Q.Value 等列分别对应不同层级。
检出率过滤阈值
常要求某蛋白在至少一组中 50% 到 70% 的样本中被检出（经验值）。阈值过松会让大量插补值进入检验，过严则会丢掉只在一组中表达的蛋白。
插补方法
左删失插补常用正态分布下移法（Perseus 默认宽度 0.3、下移 1.8 个标准差）、MinProb 或 QRILC。插补有随机性，需固定随机种子，并比较插补前后的强度分布。
差异阈值
常用 adj.P.Val < 0.05，倍数阈值 1.5 倍（|log2FC| > 0.58）或 2 倍。蛋白层面的倍数变化通常小于转录组，阈值过严会只剩很少的蛋白，应结合样本量选择。
批次与上机顺序
分多批上机时在 limma 模型中加入批次项，并用 QC 样本评估信号漂移。设计阶段应随机化上机顺序，避免同组样本集中在同一时间段采集。
常见错误
- 富集背景使用全基因组：质谱只能检出中高丰度蛋白，以全基因组为背景会让核糖体、线粒体等高丰度通路出现虚假的富集。
- 缺失值统一填 0：0 在 log 尺度上没有意义，填 0 后组间差异被极度放大，产生大量假阳性差异蛋白。
- 不报告插补比例：某差异蛋白在一组中若主要是插补值，其倍数变化实际由插补参数决定，结果表应附各组实际检出数。
- 同组样本连续上机：仪器信号漂移与分组混杂，后上机的一组整体强度偏低，被误判为生物学下调。
- 蛋白组只取第一个基因名注释：一个蛋白组可能含多个同源蛋白，取第一个会造成误配，与转录组整合时尤其明显。
- 血浆样本忽视高丰度蛋白：白蛋白、免疫球蛋白等占据大部分信号，不做去除或富集设计时，低丰度候选标志物很难检出。
结果怎么看
鉴定数统计图
每个样本的前体数和蛋白组数柱状图。同类样本应相近，个别样本明显偏低提示上样量、色谱或进样问题；鉴定数随上机顺序逐渐下降，提示仪器状态变化。
CV 分布图
对技术重复或 QC 样本计算每个蛋白的变异系数。中位 CV 经验上常在 20% 以下；分布宽、中位数高说明定量稳定性差，小幅度的差异将难以检出。
缺失值热图
展示样本 × 蛋白的检出模式。缺失集中在低强度蛋白属正常现象；若某一组整体缺失明显更多，可能是上样量或前处理差异，需要先排查再比较。
火山图与差异蛋白表
表中给出 log2FC、P 值、adj.P.Val 和各组检出数。重点复核倍数很大但某组检出数很少的蛋白，确认其差异不是由插补造成。
PCA 与相关性热图
同组样本应聚集，技术重复之间相关性应最高。若主成分按上机批次分开，需要在模型中纳入批次；单个样本与所有样本相关性都低，提示该样本质量问题。
和相近方法怎么选
DIA 与 DDA
DDA 每个循环只碎裂最强的若干前体，跨样本缺失值多；DIA 覆盖窗口内所有前体，缺失少、重复性好，更适合大队列。DDA 谱图简单，常用于建库和修饰鉴定，两者常配合使用，见 DDA 蛋白组页。
DIA-NN 与 Spectronaut
DIA-NN 免费，library-free 模式成熟、速度快；Spectronaut 为商业软件，图形界面完整，提供 directDIA 和报告模板。在常见数据上两者鉴定数接近，选择多取决于许可和实验室流程习惯。
DIA 无标定量与 TMT 标记定量
TMT 一次上机可比较多个样本，但存在比率压缩，跨批次需要桥接样本；DIA 每个样本单独上机，样本数扩展灵活，批次之间无需桥接。两种数据的处理流程不能混用，研究设计阶段就应确定。
常见问题
DIA-NN 输出的文件该用哪个？
蛋白水平分析用 pg_matrix（蛋白组矩阵），基因水平用 gg_matrix，肽段前体层面用 pr_matrix。主报告包含每个前体的完整信息和各层级 Q 值，适合按自定义规则过滤后重新汇总。
蛋白组缺失值怎么填补？
先判断缺失来源：某蛋白在一组几乎全缺、另一组都检出，多为低丰度造成，用左删失方法插补；零星随机缺失可用 KNN，或不插补直接用 limma。插补后做敏感性分析，比较不同方法下的差异蛋白是否稳定。
为什么蛋白组的差异倍数比转录组小？
蛋白水平还受翻译效率和降解速率调控，mRNA 的变化不会等比例传递到蛋白；质谱在低丰度端的定量也存在一定压缩。比较两层数据时，变化方向是否一致比倍数大小更有参考意义。
DIA 实验需要多少样本？
没有统一硬门槛。每组 3 个生物学重复是常见的最低设计；标志物研究需要更多样本，并保留独立验证集。可根据预实验的 CV 和期望检出的倍数变化估计所需样本量。
没有谱图库能做 DIA 分析吗？
可以。DIA-NN 的 library-free 模式和 Spectronaut 的 directDIA 都能直接从数据和序列库完成分析。对于低上样量或特殊组织样本，项目特异谱图库有时能进一步提高鉴定数。
在 Codar 里怎么做
Codar 先与你确认物种序列库、样本分组和比较方式，再运行 DIA 蛋白质组分析，完成肽段与蛋白鉴定和蛋白质丰度定量；随后做蛋白质组数据质量控制，检查鉴定数、变异系数、缺失值模式和样本聚类，并在 DIA 分析中完成组间差异比较。交付蛋白定量矩阵、质控图、差异蛋白表、火山图和可复现脚本。
我有 24 个小鼠肝组织的 Orbitrap DIA 原始文件，分 NASH 模型和对照两组，请用 DIA-NN 定量并找出差异蛋白