TMT 标记定量蛋白组分析
TMT（tandem mass tag）是一类等重同位素标签：不同通道的标签总质量相同，标记后的同一肽段在一级谱中是同一个峰，碎裂后释放出质量不同的报告离子，报告离子强度之比就是各样本的相对丰度。常用试剂有 TMT 10/11 标和 TMTpro 16/18 标，一次可比较十几个样本，同一批内缺失值少、定量精密度高。它的两个核心问题是：共分离的其他肽段也会贡献报告离子，使倍数变化被压向 1（比率压缩）；样本超过一个批次时，不同批次之间需要靠参考通道桥接。
什么时候用
- 十几到上百个样本的蛋白组比较，需要批内缺失值少的定量
- 时间序列或剂量梯度实验，希望同一批次内覆盖多个条件
- 样本量有限的组织或分选细胞，混合后可提高整体信号
- 与磷酸化富集结合，比较多个处理条件下的位点变化
- 临床队列样本的蛋白组分型或标志物发现（科研用途）
不适合的情况
- 需要准确的绝对倍数变化：比率压缩使倍数被低估，应用靶向方法确认
- 样本陆续到达、需要不断追加：跨批次比较依赖参考通道，追加越多越复杂
- 仅 2 到 3 个样本的小实验：试剂成本高，无标记或 DIA 更经济
需要准备的数据
- 质谱原始数据
- 各 plex 的 raw 文件，注明采集方式是 MS2 还是 SPS-MS3，是否使用 FAIMS 或实时搜索
- 通道-样本对应表
- 每个 plex 中每个通道对应的样本、分组、批次，以及参考通道位置；这张表出错会直接导致结论错误
- 同位素纯度校正因子
- 试剂批号对应的纯度校正表，由厂家随试剂提供，搜库软件中按通道录入
- 搜库结果
- MaxQuant、FragPipe 或 Proteome Discoverer 输出的 PSM 或肽段级报告离子强度，优于蛋白表
分析步骤
- 1
实验与通道设计
把各组样本随机分配到不同通道和 plex，避免某一组全部集中在一个批次。多 plex 实验中每个 plex 预留一个相同的混合参考样本通道，用于批次桥接。
- 2
标记效率检查
混合前取少量标记样本，把 TMT 作为可变修饰搜库，统计肽段 N 端和赖氨酸的标记比例。标记不完全会降低定量通道的信号，并导致部分肽段只在部分通道被检出。
- 3
搜库与纯度校正
TMT 设为肽段 N 端和赖氨酸的固定修饰，录入同位素纯度校正因子，报告离子质量容差按仪器设置。完成后查看各通道总强度是否接近，差异过大说明上样量不均。
- 4
PSM 过滤
去除反库、污染物和报告离子总强度过低的 PSM，按需过滤前体共分离干扰比例高的谱图。低强度 PSM 受噪声影响大，是比率不稳定的主要来源之一。
- 5
批内归一化
先做样本上样量归一化，例如使各通道总强度或中位数一致，再汇总为蛋白水平。归一化后画各通道的强度分布箱线图，箱体中位数应基本对齐。
- 6
跨批次桥接
多个 plex 时用参考通道做 IRS 归一化：每个蛋白以参考通道为基准，把不同 plex 缩放到同一水平。归一化前后分别做 PCA，校正前样本按 plex 聚类、校正后按生物学分组聚类说明桥接有效。
- 7
差异蛋白统计
对 log2 强度用 limma 线性模型或 MSstatsTMT 进行比较，模型中纳入批次或 plex，做 FDR 校正。结合倍数变化和校正后 P 值筛选差异蛋白，再做通路富集。
关键参数与决策
MS2 与 SPS-MS3 采集
MS2 采集速度快、鉴定数多，但共分离干扰导致比率压缩明显；SPS-MS3 在三级谱测报告离子，压缩显著减轻，但需要 Tribrid 类仪器且循环时间更长。窄隔离窗口和 FAIMS 也能部分缓解。
前体纯度过滤
部分软件提供前体离子纯度或共分离干扰指标，常用阈值是过滤掉纯度较低的谱图。阈值越严比率越准，但损失的 PSM 越多，低丰度蛋白覆盖下降。
参考通道构成
参考通道通常是所有样本等量混合的池样本，使每个蛋白都有较稳定的信号。若参考只来自部分组别，会导致某些蛋白在参考中信号弱，IRS 校正误差增大。
缺失值处理
同一 plex 内缺失很少，跨 plex 的缺失多因某 plex 未选到该肽段，属于随机缺失。常见做法是只保留在所有或大多数 plex 中检出的蛋白，避免用下移填充处理这类缺失。
常见错误
- 某一组样本集中在同一个 plex：生物学差异与批次完全混杂，任何归一化都无法分开两者。
- 标记前样本缓冲液含 Tris 等伯胺：TMT 试剂与伯胺反应，缓冲液会消耗试剂，造成标记不完全和通道间信号失衡。
- 未录入同位素纯度校正因子：相邻通道之间的信号串扰未被扣除，低丰度通道的定量偏高。
- 多 plex 只做全局中位数归一化而不用参考通道：不同 plex 选择的肽段不同，蛋白水平的批次差异无法消除。
- 把 MS2 定量得到的倍数变化当作真实大小：比率压缩下真实变化常被低估，用阈值筛选时会漏掉部分差异蛋白。
- 直接对 Proteome Discoverer 蛋白丰度做 t 检验：未利用肽段层面信息，也未考虑批次，统计效能和可靠性都较差。
结果怎么看
通道强度箱线图
每个箱体代表一个通道的 log2 强度分布。归一化前高度差异提示上样量不均，归一化后应基本对齐；如果某通道整体偏低且归一化后仍分布异常，需考虑该样本标记失败。
批次校正前后 PCA
校正前样本若按 plex 分开、校正后按生物学分组聚集，说明 IRS 桥接有效。校正后仍按 plex 分开，需检查参考通道是否设置正确；若分组信号也消失，可能存在过度校正。
差异蛋白火山图
横轴为 log2 倍数变化，纵轴为 -log10(FDR)。TMT 数据的倍数变化整体偏小，点云较窄是比率压缩的常见表现，阈值宜结合 FDR 而非仅用较大的倍数门槛。
参考通道 CV 分布
统计参考通道在各 plex 间对同一蛋白的变异系数。多数蛋白 CV 较低说明定量重复性好；CV 普遍偏高提示仪器状态或上样存在问题。
和相近方法怎么选
TMT 与 DIA 无标记定量
TMT 批内缺失少、多样本一次测定，但存在比率压缩且样本数受通道数限制。DIA 每个样本单独上机，可随时追加样本、倍数估计更接近真实，但单样本耗时更长。大队列两者都常用，按仪器与预算选择。
TMT 与 DDA 无标记定量
DDA 无标记定量每个样本单独采集，随机选择前体，缺失值多，依赖 match between runs 补全。TMT 把多样本混合，同一肽段在各通道同时被测，缺失少、精密度高，但成本和数据处理复杂度更高。
IRS 与 ComBat 批次校正
IRS 利用实验中真实存在的参考通道，在蛋白层面按同一样本校准各 plex，是 TMT 多批次的专门方案。ComBat 依赖统计模型估计批次效应，不需要参考通道，但分组与批次不平衡时容易误伤生物学差异。
常见问题
TMT 比率压缩是什么？怎么解决？
在隔离目标前体时，相近质荷比的其他肽段被一起碎裂，它们的报告离子叠加进来，使各通道比值被拉向 1。缓解办法有 SPS-MS3 采集、缩窄隔离窗口、使用 FAIMS、预分级降低样本复杂度，以及在数据处理中过滤前体纯度低的谱图。
多个 TMT 批次怎么合并分析？
关键是实验设计时在每个 plex 中放入相同的参考样本。分析时先在批内归一化，再用参考通道做 IRS 归一化把各批次缩放到同一水平，统计模型中保留 plex 作为协变量，并用 PCA 检查批次效应是否被去除。
TMT 数据用 MaxQuant 还是 Proteome Discoverer？
都可以。MaxQuant 免费，输出 evidence 和 proteinGroups 表；Proteome Discoverer 是商业软件，与 Thermo 仪器集成好；FragPipe 也有 TMT 流程。关键看能否导出 PSM 级报告离子强度，便于用 MSstatsTMT 等工具统计。
TMT 数据要不要做缺失值填充？
批内缺失很少，跨批次缺失多属于随机缺失，通常不建议用为低丰度设计的下移填充。常见做法是只分析在所有或大多数 plex 中检出的蛋白，或使用能处理缺失的线性模型。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 TMT 搜库结果、通道-样本对应表和分组信息后，会先确认 plex 结构、参考通道和比较方案，再进行 TMT 定量蛋白质组分析：报告离子过滤、批内与跨批次参考通道归一化、质控检查和差异蛋白统计。交付归一化定量表、通道箱线图、校正前后 PCA、火山图、报告和可复现脚本。
我有 3 个 TMTpro 16 标批次共 45 个肝组织样本的 MaxQuant 结果，每批第 16 通道是混合参考，想做批次校正和差异蛋白分析