DDA 蛋白组鉴定与 MaxQuant 定量
数据依赖采集（DDA）是经典的鸟枪法蛋白组采集方式：仪器在每个一级扫描中挑选强度最高的若干前体离子依次碎裂，得到二级谱图。分析分三层：把谱图与序列库酶切产生的理论谱图匹配，鉴定肽段；把肽段归属到蛋白，处理共享肽段带来的歧义；再对蛋白做定量。MaxQuant 是常用的免费软件，内置 Andromeda 搜索引擎和 MaxLFQ 定量，常配合 Perseus 统计；FragPipe、Proteome Discoverer 也很常用。DDA 鉴定可信、谱图可追溯，但前体选择有随机性，样本间缺失值较多。
什么时候用
- 细胞系或组织的常规蛋白组比较，样本数较少到中等
- 免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定互作蛋白
- 鉴定纯化蛋白或胶条中的蛋白成分
- 为 DIA 分析构建项目特异的谱图库
- 非模式物种或自建序列库的蛋白鉴定
不适合的情况
- 数百例样本的大队列定量：DDA 缺失值随样本数增多而累积，DIA 或 TMT 更合适
- 低丰度蛋白在每个样本中都需稳定定量：DDA 前体选择随机，容易时有时无
- 只看一两个蛋白的准确定量：应使用 PRM 或 MRM 等靶向方法
需要准备的数据
- 质谱原始文件
- Thermo raw 或 Bruker .d 等格式；同一实验应使用相同的色谱梯度和仪器方法
- 蛋白序列数据库
- UniProt 对应物种的 FASTA，通常选 reviewed 加必要的 isoform；外加常见污染物库
- 实验设计表
- raw 文件与样本名、分组、技术重复、分级组分的对应关系；分级样本需归到同一实验名下
- 修饰与酶切信息
- 使用的酶、烷基化试剂、是否有标记，以及研究关心的修饰，决定固定修饰和可变修饰设置
分析步骤
- 1
设置搜库参数
酶选 Trypsin/P，最多漏切常设 2；固定修饰为半胱氨酸脲甲基化，可变修饰为甲硫氨酸氧化和蛋白 N 端乙酰化。可变修饰每加一种，搜索空间成倍扩大，只加确有必要的。
- 2
质量容差与校准
Orbitrap 数据在 MaxQuant 中一般使用默认的首轮 20 ppm、主搜索 4.5 ppm 前体容差，软件会先做质量校准。搜完后查看前体质量误差分布，应以 0 为中心且较窄。
- 3
FDR 控制
用靶标-诱饵策略，在 PSM、肽段和蛋白层面分别控制 FDR，常用 1%。检查鉴定率：二级谱图被成功鉴定的比例明显偏低时，可能是物种选错、存在未设置的修饰或样本降解。
- 4
蛋白推断与分组
共享肽段使多个蛋白无法区分时会被合并成蛋白组。MaxQuant 把共享肽段分配给证据最多的蛋白组，称为 razor 肽段。定量通常使用 unique 加 razor 肽段。
- 5
MBR 与 LFQ 定量
开启 match between runs，按保留时间和质荷比把一个样本中的鉴定转移到其他样本，减少缺失值。开启 LFQ 后用 MaxLFQ 归一化，得到 LFQ intensity 列。
- 6
结果过滤
读取 proteinGroups.txt，去掉反库命中、污染物和仅由修饰位点鉴定的条目。然后做 log2 转换，按每组有效值数量过滤，检查样本间强度分布和相关性。
- 7
缺失值与差异分析
DDA 缺失多与低丰度相关，Perseus 常用从正态分布下移抽样填充，默认宽度 0.3、下移 1.8。填充后用 t 检验或 limma 比较，并比较填充与不填充的结果是否一致。
关键参数与决策
FDR 阈值
常用 PSM 和蛋白层面各 1%。放宽到 5% 能多鉴定一些蛋白，但大样本时假阳性数量明显增加。只由一条肽段支持的蛋白，在报告中应单独标注。
match between runs
MBR 能显著减少缺失值，但会产生错误转移，尤其是一组中确实不存在的蛋白可能被错误补上。样本差异很大时，例如不同组织类型或 IP 与对照，宜谨慎开启或对比开关结果。
LFQ 最小比率数
MaxLFQ 用肽段在样本间的比率计算蛋白强度，默认最小比率数为 2。提高到更大值使定量更稳但缺失增多；降到 1 可覆盖更多蛋白但精度下降。
数据库选择
只用 reviewed 序列可减少冗余和蛋白组歧义；加入全部 TrEMBL 序列会使数据库成倍增大、诱饵分布改变，鉴定数可能反而下降。非模式物种可用转录组翻译的序列库。
常见错误
- 忘记加污染物库：角蛋白、胰酶等外源蛋白会被错配到目标物种蛋白上，或混进差异结果被误读。
- 用 iBAQ 或原始 intensity 做样本间差异分析：未经样本间归一化，上样量差异会直接变成假的倍数变化。
- IP-MS 实验开启 MBR：对照组的空白会被错误填上信号，削弱富集倍数，使真实互作蛋白不显著。
- 下移填充后只按倍数变化筛选：一组几乎全为填充值时倍数被人为放大，应同时查看有效值数量。
- 把蛋白组中的第一个蛋白当作唯一鉴定结果：同一蛋白组中可能有多个同源蛋白或 isoform，结论应写到能区分的层级。
- 含尿素的裂解液加热处理：尿素分解会使肽段发生氨甲酰化，搜库未设置该修饰时大量谱图无法鉴定，鉴定率明显下降。
结果怎么看
鉴定数量与鉴定率
各样本的 MS/MS 鉴定率、肽段数和蛋白组数。同类样本应相近；个别样本明显偏低，提示上样、色谱或电喷雾问题，需要决定是否重测或剔除。
强度分布与相关性热图
各样本 log2 LFQ 强度箱线图应在归一化后对齐，样本间 Pearson 相关热图中同组样本相关更高。若样本按上机顺序而非分组聚类，提示仪器漂移或批次影响。
缺失值模式图
展示每个蛋白在各样本中是否被定量，按强度排序。缺失集中在低强度蛋白属于常见的低丰度缺失；缺失集中在某几个样本，提示这些样本质量差。
差异蛋白火山图
横轴为 log2 倍数变化，纵轴为 -log10 P 值或 FDR。远离中心但有效值很少的点需要核查；IP-MS 中可在横轴正方向上寻找显著富集的诱饵蛋白及其互作蛋白。
和相近方法怎么选
DDA 与 DIA
DDA 每次只碎裂选中的前体，谱图干净、鉴定可直接溯源，但样本间缺失多。DIA 按窗口碎裂全部前体，定量完整性和重复性更好，适合大样本；但谱图复杂，需要谱图库或无库算法解析。
MaxQuant 与 FragPipe
MaxQuant 集成 Andromeda 和 MaxLFQ，流程成熟、资料多，但大数据集运行慢。FragPipe 基于 MSFragger，搜索快，开放搜索可发现未知修饰，并有 IonQuant 定量。两者结果通常可比，按数据规模和习惯选择。
LFQ、iBAQ 与谱图计数
LFQ 用于同一蛋白在样本间的相对比较；iBAQ 用强度除以理论肽段数，适合样本内不同蛋白之间粗略比较丰度；谱图计数简单但对低丰度蛋白不敏感，主要用于 IP-MS 等富集评分。
常见问题
MaxQuant 结果中 LFQ intensity 和 Intensity 有什么区别？
Intensity 是蛋白组内肽段强度的直接加和，没有在样本间归一化；LFQ intensity 是 MaxLFQ 算法基于肽段比率计算、并做过样本间归一化的结果。样本间比较一般用 LFQ intensity，样本内不同蛋白的丰度比较用 iBAQ。
1% FDR 是什么意思？
在通过阈值的鉴定结果中，预计约有 1% 是错误匹配。它通过在序列库中加入反转的诱饵序列来估计：诱饵命中数近似代表错误命中数。PSM、肽段和蛋白各层 FDR 需分别控制，蛋白层面误差会因合并而放大。
proteinGroups 表中哪些行需要删除？
通常删除 Reverse 列为加号的反库命中、Potential contaminant 为加号的污染物，以及 Only identified by site 为加号的仅由修饰位点鉴定的蛋白。之后再按每组有效值数量过滤，并保留蛋白组 ID 以便追溯。
DDA 数据缺失值这么多正常吗？
正常。DDA 前体选择有随机性，低丰度肽段在部分样本中未被选中，造成缺失；样本数越多，所有样本都有值的蛋白越少。开启 MBR 能补回一部分，下游再按有效值过滤和填充，并在报告中说明处理方式。
MaxQuant 鉴定率很低是什么原因？
常见原因有：序列库物种或版本不对；样本中有未设置的修饰，如尿素引起的氨甲酰化；样本降解导致大量非特异酶切肽段；质量校准异常。可以先用开放搜索查看高频质量偏移，定位缺失的修饰后再调整参数。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 DDA 原始数据或已有 MaxQuant 结果、序列库和实验设计后，会先确认物种、修饰和 FDR 标准，再进行蛋白质质谱数据处理和肽段鉴定与蛋白质推断：整理鉴定结果、控制 FDR、汇总蛋白组，并完成过滤、归一化与缺失值处理。交付鉴定质控图、蛋白定量表、报告和可复现脚本。
我有 3 个对照和 3 个敲除 HeLa 细胞的 DDA raw 文件，想做肽段鉴定和蛋白推断，按 1% FDR 输出过滤后的 LFQ 蛋白定量表