翻译后修饰与磷酸化蛋白组分析
蛋白质的磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化等翻译后修饰（PTM）决定其活性、定位和降解，信号转导的快速变化主要体现在修饰水平。修饰肽段丰度低，通常需要先富集：磷酸化肽常用 TiO2 或 Fe-IMAC、Ti-IMAC，酪氨酸磷酸化和乙酰化、泛素化（K-ε-GG 残基）多用抗体富集。与普通蛋白组相比，PTM 分析的单位是位点而不是蛋白，需要额外解决两个问题：修饰到底在肽段的哪个氨基酸上（位点定位），以及位点信号的变化是来自修饰比例改变还是蛋白总量改变。下游常做激酶活性推断和基序分析。
什么时候用
- 药物或配体处理后，观察信号通路在分钟到小时尺度上的激活与抑制
- 比较激酶抑制剂处理前后的磷酸化位点，评估靶点与脱靶效应
- 研究乙酰化、泛素化等修饰在代谢或蛋白降解中的调控作用
- 肿瘤样本中推断激酶活性，寻找过度活化的信号通路
- 为定点突变实验筛选具体的修饰位点
不适合的情况
- 未经富集的普通蛋白组数据：修饰肽极少，位点覆盖和定量都不可靠
- 只有修饰组没有全蛋白组，却要区分修饰比例变化与蛋白总量变化
- 以单个低定位概率位点为依据设计突变：修饰可能在相邻的 S、T 或 Y 上
需要准备的数据
- 富集后的质谱原始数据
- DDA、DIA 或 TMT 采集的 raw 文件；同时记录富集方法和起始蛋白量，富集效率是质控指标之一
- 搜库结果位点表
- 如 MaxQuant 的 Phospho (STY)Sites.txt，需含位点定位概率、修饰多重度和各样本强度
- 配对全蛋白组数据
- 同一批样本未富集部分的蛋白定量，用于把位点变化校正到蛋白水平
- 样本信息与参考库
- 分组、时间点和批次信息，以及与搜库一致的 UniProt FASTA，用于提取位点周围序列窗口
分析步骤
- 1
搜库设置修饰
在常规固定和可变修饰之外，把目标修饰设为可变修饰，如磷酸化 STY（+79.966 Da）、乙酰化 K（+42.011 Da）、GG 残基 K（+114.043 Da）。可变修饰太多会扩大搜索空间、降低鉴定数，应只加需要的修饰。
- 2
检查富集效率
统计含目标修饰的肽段占全部鉴定肽段的比例。磷酸化富集良好时修饰肽占大多数；比例明显偏低说明富集失败或样本量不足，后续定量的缺失值会很多。
- 3
位点定位过滤
用定位概率筛选可信位点，MaxQuant 常用定位概率大于 0.75 作为 class I 位点的经验标准，其他软件有 ptmRS、Ascore 等对应分数。低定位概率的位点只能报告为肽段上的修饰，不能指定具体氨基酸。
- 4
展开多重度并整理
同一位点可能出现在单磷酸化、双磷酸化等不同肽段中，MaxQuant 用 ___1、___2、___3 区分多重度。需先展开成位点-多重度的长表，再决定合并或分开分析，否则会重复计数。
- 5
归一化与蛋白校正
对位点强度做 log2 转换和样本间中位数归一化。有配对全蛋白组时，用位点变化减去对应蛋白的变化，或在线性模型中把蛋白丰度作为协变量，得到修饰占比层面的变化。
- 6
差异位点分析
按位点用 limma 等方法比较组间差异并做 FDR 校正。修饰数据缺失值比例高，常要求每组内有足够有效值再检验，填充时应考虑低丰度缺失的特点并做敏感性比较。
- 7
激酶活性与基序分析
用 KSEA 基于已知激酶-底物关系、或用 PTM-SEA 基于 PTMsigDB 位点集推断激酶和通路活性；用位点前后各 7 个氨基酸的序列窗口做基序富集，判断上调位点是否偏向某类激酶的识别基序。
关键参数与决策
定位概率阈值
阈值越高位点越可信但数量越少。常用 0.75，要求严格的研究会用更高阈值。差异分析可在全部位点上做，但报告具体位点和设计突变时只用高定位概率位点。
有效值过滤
常见要求是至少一组内大部分样本有定量值。过滤过松会让大量填充值参与检验，假阳性增加；过严会丢掉只在某种处理下出现的开关型位点，这类位点可单独列出。
蛋白水平校正方式
简单相减直观，但蛋白定量本身有误差，会把误差带入位点结果；把蛋白丰度作为协变量更稳健。没有对应蛋白定量的位点无法校正，应在结果中标注。
激酶-底物数据库
KSEA 常用 PhosphoSitePlus 等整理的激酶-底物关系，可选择是否加入 NetworKIN 等预测关系。只用实验证据时覆盖的激酶少但更可靠；加入预测关系覆盖面扩大但噪音增加。
常见错误
- 把位点强度变化直接解释为修饰水平变化：蛋白总量上升也会导致位点信号上升，没有全蛋白组校正时结论可能颠倒。
- 按肽段而非位点统计结果：同一位点出现在多个肽段中会被重复计数，差异位点数量被夸大。
- 忽略多重度：单磷酸化与双磷酸化形式的同一位点可能变化方向相反，直接合并会抵消真实信号。
- 把激酶活性分数当作激酶表达量：KSEA 推断的是底物位点整体变化，已知底物很少的激酶得分不稳定。
- 用未富集样本的少量修饰肽做结论：这些多为高丰度蛋白上的修饰，覆盖有限且定量不稳定。
结果怎么看
位点火山图
横轴为 log2 倍数变化，纵轴为 -log10(FDR)，每个点是一个位点。经过蛋白校正前后各画一张对比，若校正后显著位点大幅减少，说明原先的变化主要来自蛋白总量而非修饰比例。
位点定位概率分布
展示所有位点的定位概率直方图，理想情况下大多数集中在接近 1 的位置。低概率位点比例很高时，提示碎裂谱图质量差或搜库设置有问题，具体位点结论需谨慎。
激酶活性条形图
列出 KSEA 或 PTM-SEA 中显著的激酶或位点集，方向表示活化或抑制，旁边注明支持的底物位点数。只有两三个底物支撑的激酶即使显著也需结合文献和验证实验判断。
序列基序图
以位点为中心展示前后各 7 个氨基酸的富集情况，字母大小代表富集程度。脯氨酸紧随其后的 S/T-P 基序提示脯氨酸导向激酶，精氨酸在上游的 R-x-x-S 基序提示碱性导向激酶。
和相近方法怎么选
PTM 组学与全蛋白组差异分析
全蛋白组以蛋白为单位，汇总多条肽段，变化反映合成与降解；PTM 组学以位点为单位，变化反映信号状态，需要富集和位点定位。两者配对时最有解释力，PTM 结果应以全蛋白组为背景解读。
KSEA 与 PTM-SEA
KSEA 以激酶为单位，把其已知底物位点的倍数变化汇总成活性分数，计算简单。PTM-SEA 借鉴 ssGSEA 思路，使用 PTMsigDB 中带方向的位点集，可覆盖通路和扰动特征，但依赖位点注释与数据库的匹配程度。
磷酸化 DDA、DIA 与 TMT 定量
DDA 无标记定量缺失值最多；DIA 位点定量更完整，但位点定位需要软件专门支持；TMT 多重标记缺失少、适合多样本，但存在比率压缩。样本量大、需比较多时间点时 TMT 和 DIA 更常用。
常见问题
磷酸化位点定位概率 0.75 是什么意思？
表示软件估计修饰位于这个氨基酸上的概率为 75%。MaxQuant 相关研究把大于 0.75 的位点称为 class I 位点，这是常用经验标准。肽段上有多个 S、T、Y 且碎片离子不足时，定位概率会偏低。
磷酸化数据一定要配全蛋白组吗？
强烈建议配。没有全蛋白组时，位点信号上升可能只是蛋白表达上调。对短时间刺激实验，蛋白总量变化通常较小，影响相对有限；对长时间处理或不同组织比较，缺少全蛋白组会严重影响解释。
MaxQuant 位点表中的 ___1、___2、___3 是什么？
代表同一位点所在肽段携带的修饰个数，即单修饰、双修饰和三个及以上修饰。Perseus 中可用 expand site table 把它展开成多行。分析时可以分开保留，也可以按位点合并，但需在方法中说明。
乙酰化和泛素化组学的分析流程和磷酸化一样吗？
整体框架相同：富集、搜库设可变修饰、位点定位、蛋白水平校正、差异分析和富集分析。区别在于富集方式通常是抗体，泛素化位点以胰酶酶切后在赖氨酸上留下的 GG 残基识别，且没有成熟的激酶活性推断对应工具。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供修饰组搜库结果（如位点表）、可选的配对全蛋白组定量和分组信息后，会先确认修饰类型、定位概率阈值和是否做蛋白水平校正，再进行蛋白质翻译后修饰分析：位点过滤与归一化、差异位点检验，并按需做激酶活性和序列基序分析。交付差异位点表、火山图、激酶活性图、报告和可复现脚本。
我有 EGF 刺激 0、5、30 分钟的磷酸化组 MaxQuant 结果和配对全蛋白组，想找变化的位点并推断哪些激酶被激活