GO 与 KEGG 功能富集分析
GO 与 KEGG 富集分析回答「这批基因集中在哪些功能或通路上」。它属于过表征分析（ORA）：给定一份基因列表，如差异基因、WGCNA 模块基因或亚群 marker，以本实验检测到的基因为背景，用超几何检验判断某个 GO 条目或 KEGG 通路中的列表基因是否多于随机预期。GO 分为生物过程、细胞组分、分子功能三个本体，层级细、覆盖广；KEGG 以代谢和信号通路为单位。R 中常用 clusterProfiler，网页工具有 DAVID、Metascape。
什么时候用
- 解释 RNA-seq 或芯片差异表达基因主要涉及哪些生物过程和通路
- 为 WGCNA 模块、单细胞亚群 marker 等基因集赋予功能标签
- 并列比较多组基因列表，如上调与下调、不同聚类簇的功能差异
- 对蛋白组、甲基化等其他组学得到的基因层面结果做功能注释
- 从差异结果中挑选值得优先验证的通路和代表基因
- 对比不同处理、时间点或细胞类型的差异基因，找出共有和特有功能
不适合的情况
- 差异基因只有个位数或十几个时，ORA 几乎没有统计效力，应改用 GSEA
- 想比较每个样本的通路活性高低，应使用 ssGSEA 或 GSVA 打分
- 把富集结果写成通路被激活或抑制，ORA 本身不提供方向信息
需要准备的数据
- 目标基因列表
- 一行一个基因，统一为 SYMBOL、ENTREZID 或 ENSEMBL 中的一种，Ensembl ID 去掉版本号
- 背景基因集
- 通常是本实验中检测到并通过表达过滤的全部基因，而非全基因组注释
- 物种注释
- 人用 org.Hs.eg.db、小鼠用 org.Mm.eg.db；KEGG 物种代码如 hsa、mmu
- 分组信息（可选）
- 上调、下调或多个簇的列表，用于 compareCluster 并列比较
分析步骤
- 1
确定基因列表
按明确阈值从差异结果中取基因，例如 padj<0.05 且 |log2FC|>1，并把上调和下调分开保存。记录阈值和基因数；基因只有几十个以下时富集结果波动很大，需要在报告中说明。
- 2
统一基因 ID
用 clusterProfiler 的 bitr() 把 SYMBOL 转为 ENTREZID，enrichKEGG 默认需要 Entrez ID。检查转换失败的比例，若超过一成，多半是混入了版本号、旧基因名或物种选错。
- 3
设定背景基因
把表达过滤后保留的全部基因传给 universe 参数。若用全基因组作背景，组织中本就高表达的通路会显得格外显著，这是结果「满屏免疫通路」的常见原因之一。
- 4
运行 GO 富集
enrichGO 指定 OrgDb、keyType 和 ont（BP、CC、MF 或 ALL），pAdjustMethod 常用 BH。核对 GeneRatio 的分母：它应是列表中能注释到 GO 的基因数，而不是原始输入数。
- 5
运行 KEGG 富集
enrichKEGG 将 organism 设为 hsa 等物种代码。该函数需要在线访问 KEGG，网络不可用时会报错；离线环境可用本地整理的通路-基因对应表，交给 enricher() 做通用富集。
- 6
去除冗余条目
GO 条目层级重叠严重，可用 simplify() 按语义相似度合并相近条目，常用 cutoff 为 0.7；也可用 emapplot 把共享基因多的条目聚成主题，再从每个主题挑代表条目。
- 7
出图与导出
dotplot 或 barplot 展示排名靠前的条目，cnetplot 展示基因与条目的对应关系。导出完整结果表，保留 ID、Description、GeneRatio、BgRatio、p.adjust、geneID 等列，便于复核。
关键参数与决策
pvalueCutoff 与 qvalueCutoff
默认 pvalueCutoff 0.05、qvalueCutoff 0.2，过滤基于校正后 P 值。报告以 p.adjust 为准；结果为空时不要改用原始 P 值凑结果，先检查列表和背景。
minGSSize 与 maxGSSize
默认 10 和 500，用来排除过小和过大的条目。过大的条目如「代谢过程」信息量低，过小的条目命中一两个基因就可能显著，必要时可收紧到 15–300 左右。
ont 本体选择
BP 最常用于解释生物学过程；CC 和 MF 适合蛋白组或亚细胞定位类问题。选 ALL 时三个本体一起做多重校正，条目数明显增加，图上需按本体分面展示。
上调和下调是否分开
合并做只能得到「这些功能有变化」，方向相反的信号还会互相稀释。分开做可以看出哪些功能集中在上调基因、哪些集中在下调基因，更便于写机制推断。
背景 universe
背景决定每个条目的期望命中数。bulk 数据建议用过滤后检测到的基因；单细胞数据建议用在一定比例细胞中表达的基因，不要用全部注释基因。
常见错误
- 不设背景基因，默认使用注释库全部基因：组织中本就高表达的通路被系统性高估，结论反映的是组织背景而不是处理效应。
- 报告原始 P 值而非校正后 P 值：GO 条目数以千计，未校正的显著结果中假阳性比例很高，审稿时容易被直接指出。
- 把「Pathways in cancer」这类大而泛的 KEGG 通路当成核心发现：它们包含大量通用信号分子，几乎任何基因列表都容易命中。
- ID 转换静默丢失基因：人类基因全大写、小鼠首字母大写，大小写混用或带 Ensembl 版本号时，一部分基因会悄悄掉出分析。
- 把富集到的通路写成被激活或被抑制：ORA 只说明基因集中出现，方向需要靠上下调分开分析或 GSEA 判断。
- 只截取前 10 个条目画图却不交代筛选规则：读者无法判断是否经过挑选，应附完整结果表并写明排序依据。
结果怎么看
富集气泡图（dotplot）
横轴通常是 GeneRatio，点的大小是命中基因数，颜色是 p.adjust。优先关注颜色深且 GeneRatio 高的条目；如果靠前的全是包含上千基因的宽泛条目，说明需要收紧 maxGSSize 或先去冗余。
富集结果表
GeneRatio 是命中数除以列表中有注释的基因数，BgRatio 是条目基因数除以背景中有注释的基因数，两者之比即富集倍数。geneID 列列出命中基因，可回查结果是否由同一基因家族驱动。
基因-条目网络图（cnetplot）
展示哪些基因同时参与多个条目。若多个显著条目几乎共享同一批基因，它们代表的是同一个信号，写结果时应合并叙述，而不是当作多项独立发现。
条目关系图（emapplot）
节点是条目，边表示共享基因。成团的节点构成一个功能主题，便于把几十个条目归纳成两三条主线；孤立且命中基因很少的节点，往往是不稳定的偶然结果。
KEGG 通路图
用 pathview 等工具把 log2FC 映射到 KEGG 通路图的基因框上，红绿表示上下调。看变化基因集中在通路的上游受体、中间激酶还是下游效应分子，可以帮助判断哪一段信号最可能受影响。
和相近方法怎么选
ORA 富集与 GSEA
ORA 只使用阈值筛出的基因，简单直观，适合差异基因较多、信号明确的情况；GSEA 使用全部基因的排序，不依赖阈值，能捕捉许多基因同时小幅变化的通路，并给出方向。差异基因很少时优先用 GSEA。
GO、KEGG 与 Reactome
GO 覆盖最广但层级冗余，需要去冗余；KEGG 通路图直观，以代谢和经典信号通路为主；Reactome 注释层级更细，可用 ReactomePA 包分析。论文中常 GO 与 KEGG 并报，Reactome 作为补充。
clusterProfiler 与 DAVID、Metascape
clusterProfiler 可脚本化、可自定义背景、便于复现；DAVID 和 Metascape 是网页工具，上手快，但注释版本随网站更新，复现时需记录访问日期和数据库版本，背景基因的设置也不如脚本灵活。
常见问题
GO 富集分析结果为空怎么办？
先查三点：ID 转换是否大量失败，keyType 是否与实际 ID 类型一致，基因列表是否过短。若都正常，说明这批基因功能较分散，可以重新审视差异阈值或改用 GSEA，而不是把筛选条件换成原始 P 值。
GeneRatio 和 BgRatio 分别是什么意思？
GeneRatio 是列表中落入该条目的基因数除以列表中有注释的基因总数；BgRatio 是该条目在背景中的基因数除以背景中有注释的基因总数。GeneRatio 明显高于 BgRatio 才说明该条目在列表中富集。
KEGG 富集一定要用 Entrez ID 吗？
enrichKEGG 默认 keyType 为 kegg，对人类而言就是 Entrez ID，所以通常先用 bitr 转换。结果出来后可用 setReadable 把 Entrez ID 转回基因符号，便于阅读和作图。
上调和下调基因要分开做富集吗？
多数情况下建议分开。合并后无法区分功能来自哪个方向，方向相反的基因还可能互相稀释。若想在一张图里看全貌，可以用 compareCluster 把上调、下调结果并列展示。
做富集分析的基因数多少合适？
没有硬性标准，经验上几十到几百个基因结果较稳定。少于 20 个时单个基因就能左右条目是否显著；超过两三千个时大条目几乎都会显著，此时应收紧阈值或改用 GSEA。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中，上传差异基因表或基因列表，说明物种和比较方向即可。Codar 会先确认基因 ID 类型、背景基因和筛选阈值，再完成 GO 三个本体与 KEGG 通路的富集分析，需要时按上调、下调分别计算并合并冗余条目。交付富集结果表、气泡图、条形图、基因-条目网络图、报告和可复现的 R 脚本。
这是我的 DESeq2 结果（人，肿瘤 vs 癌旁），请按 padj<0.05、|log2FC|>1 分上下调做 GO 和 KEGG 富集，背景用检测到的基因。
