GSEA 基因集富集分析与 ssGSEA、GSVA
GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）不预先挑选差异基因，而是把全部基因按与表型的关联强度排序，检验一个基因集的成员是否集中在排序列表的顶端或底端。它适合「单个基因变化不大、但整条通路协同变化」的情形，并给出方向。ssGSEA 和 GSVA 是样本级延伸，把基因 × 样本矩阵转为基因集 × 样本评分矩阵，便于做组间比较、相关和聚类。常用工具有 GSEA 桌面版、clusterProfiler、fgsea 和 GSVA 包，基因集多来自 MSigDB。
什么时候用
- 差异基因很少，但怀疑某些通路整体上调或下调
- 需要知道通路变化的方向，而不只是「是否相关」
- 用 MSigDB Hallmark 等基因集概括一次实验的整体转录变化
- 为每个样本计算通路或细胞特征评分，再与分组或表型关联
- 单细胞亚群比较时，对差异统计量或 pseudobulk 结果做通路排序分析
不适合的情况
- 只有一份没有排序指标的基因列表，应使用 GO/KEGG 过表征分析
- 每组只有两三个样本却对 ssGSEA 评分做组间检验，方差估计不可靠
- 把 ssGSEA 免疫特征评分当作细胞比例，二者含义不同
需要准备的数据
- 排序基因列表
- 全部检测基因及其排序指标，如 DESeq2 的 stat；去除重复基因名和缺失值，不要只放差异基因
- 表达矩阵
- GSEA 桌面版和 GSVA 需要基因 × 样本矩阵，行名 ID 类型须与基因集一致
- 基因集
- GMT 文件，或用 msigdbr 按物种和集合（H、C2、C5 等）获取
- 样本分组
- 两组比较的表型标签；评分后的差异分析还需要设计矩阵和协变量
分析步骤
- 1
选择排序指标
推荐用兼顾效应量和可信度的统计量，如 DESeq2 的 Wald stat 或 limma 的 t 值；只用未收缩的 log2FC 会把低表达基因的噪声推到两端。排序后先看两端基因是否符合预期。
- 2
准备基因集
先用 MSigDB Hallmark（H）集合做整体概览，再按研究问题加入 C2 通路或 C5 GO。用 msigdbr 获取时确认物种和基因 ID 类型与排序列表一致，记录 MSigDB 版本。
- 3
运行 GSEA
R 中可用 clusterProfiler 的 GSEA() 或 fgsea，输入是按降序排列、带基因名的数值向量。固定随机种子保证置换结果可复现，并检查有多少基因因 ID 不匹配被丢弃。
- 4
筛选与排序结果
按校正后 P 值或 FDR q 值筛选，再按 NES 排序。正负 NES 分开整理，分别代表在比较组和参照组中整体偏高的基因集，避免在同一张图里混读。
- 5
核查曲线与核心基因
对重点基因集画富集曲线，确认 ES 峰值出现在列表一端而非中段；提取 leading edge 基因，看信号是由多数成员共同贡献，还是只靠少数几个基因。
- 6
计算样本级评分
需要每个样本的分数时，用 GSVA 包计算 GSVA 或 ssGSEA 评分；log 尺度表达用 Gaussian 核，原始整数计数用 Poisson 核。得到基因集 × 样本矩阵后先画热图看整体模式。
- 7
评分的下游分析
可用 limma 对 GSVA 分数做组间差异，或与表型变量做相关。报告时写明评分方法、核函数和基因集版本，因为不同方法得到的分数尺度不同，不能混合比较。
关键参数与决策
排序指标
常用 stat、t 值或 sign(log2FC)×−log10(P)。fgsea 提示存在大量相同数值（ties）时，说明指标离散，建议换成连续统计量，而不是忽略警告。
置换类型
按表型置换能保留基因间相关结构，更严谨；GSEA 官方建议任一组少于 7 个样本时改用 gene_set 置换。R 中预排序 GSEA 只能做基因集置换，解读 FDR 时要考虑这一点。
基因集大小范围
GSEA 桌面版默认只分析 15–500 个基因的集合。过小的集合 NES 波动大，过大的集合内部方向混杂、难以解释，一般沿用这一范围即可。
显著性阈值
GSEA 文档指出在探索性分析中 FDR<0.25 可作为候选；写入核心结论时建议同时看校正 P 值，并采用 0.05 这类更严格的阈值。
GSVA 的 kcdf
决定如何估计每个基因的表达分布：标准化后的 log 表达或芯片数据用 Gaussian，RNA-seq 原始整数计数用 Poisson。选错会让评分分布失真。
ssGSEA 还是 GSVA
两者都给样本级分数，且都会参考整批样本做归一化，样本增删后需整体重算。ssGSEA 常用于免疫细胞特征打分，GSVA 在样本较多时分布更平滑，选定一种并说明理由。
常见错误
- 只用差异基因做 GSEA：方法依赖全部基因的排序，截取后背景被破坏，置换检验失去意义，结果整体偏向显著。
- 排序列表中有重复基因名：Ensembl 转基因名常出现多对一，不去重会让同一基因占据多个位置，抬高 NES。
- 比较方向弄反：NES 的正负取决于哪组是比较组，若对照写在前面，所有结论方向都会反过来，出图前要核对对比设置。
- 把 FDR<0.25 当作最终结论：该阈值本意供假设生成使用，论文的核心结论应配合更严格的校正 P 值或独立数据验证。
- 直接比较不同数据集的 GSVA 分数：评分是相对本批样本计算的，跨数据集合并比较会把批次差异误当作生物学差异。
- 把 C2、C5 等集合混在一起统一检验：同一通路在多个集合中重复出现，既加重多重检验负担，又导致重复报告。
结果怎么看
GSEA 结果表
核心列为 NES、P 值、校正 P 值或 FDR q 值以及 leading edge。NES 绝对值大且 q 值小的基因集最可信；若显著条目几乎都是相似通路，说明是同一信号的重复。
富集曲线图
上方曲线是 running ES，峰值越靠左表示在比较组中越偏高；中间竖线是基因集成员在排序中的位置。若竖线均匀分布、ES 峰值很低，即使 P 值显著也应谨慎解读。
leading edge 核心基因
列出对 ES 贡献最大的成员。多个显著基因集共享同一批核心基因时，可合并为一个生物学主题；核心基因只有两三个时，结论稳健性较差。
GSVA/ssGSEA 评分热图
行为基因集、列为样本，按分组排列。看分组是否沿某些通路明显分开；若样本主要按批次而非分组聚在一起，说明评分前没有处理批次效应。
山脊图（ridgeplot）
每条山脊是一个显著基因集中核心基因的 log2FC 分布。整体右移表示该集合在比较组中偏高；若分布很宽、正负都有，说明集合内部方向不一致，解读时应结合 leading edge 基因。
和相近方法怎么选
GSEA 与 GO/KEGG 富集
GO/KEGG 过表征分析依赖阈值筛出的差异基因，GSEA 使用完整排序，不需要阈值，并给出方向。差异基因多且明确时两者结论通常一致；差异基因少或需要方向时以 GSEA 为主。
ssGSEA 与 GSVA
两者都把表达矩阵转为样本级评分。ssGSEA 常见于免疫和特征基因集打分，GSVA 在样本数较多时分布更平滑。选定一种并说明理由，不要两种都算后挑结果更好看的。
GSVA 评分与免疫浸润反卷积
GSVA 给出的是基因集的相对富集评分，不是细胞比例；CIBERSORT 等反卷积方法估计细胞组成比例。想比较细胞比例时应使用反卷积方法，评分只能作补充。
clusterProfiler 与 fgsea
fgsea 计算快，适合大量基因集；clusterProfiler 的 GSEA 系列函数默认调用 fgsea 计算，并配有 gseaplot2、ridgeplot 等可视化函数，适合直接出图。
常见问题
GSEA 结果怎么看？
先看 NES 正负确定方向，再看 FDR 或校正 P 值判断可信度，然后打开富集曲线确认峰值位于列表一端，最后查看 leading edge 基因是否合理。只看 P 值、不看曲线和核心基因，容易误读。
NES 是什么，为什么不直接看 ES？
ES 是富集曲线偏离零的最大值，受基因集大小影响；NES 是把 ES 除以置换得到的同向 ES 均值后的标准化结果，可在不同大小的基因集之间比较，所以筛选和排序都用 NES。
GSEA 用 log2FC 排序还是用 stat 排序？
两种都常见。stat 或 t 值同时考虑效应和方差，对低表达噪声更稳健，通常更推荐；若坚持用 log2FC，建议先用 DESeq2 的 lfcShrink 做收缩，减少低计数基因的极端值。
ssGSEA 和 GSVA 的评分能做差异分析吗？
可以，常用 limma 对评分矩阵做组间比较，因为评分近似连续分布。基因集数量就是检验次数，必须做多重校正；样本很少时，结果只宜作为探索性证据。
为什么每次运行 GSEA 结果略有不同？
P 值来自随机置换，不同运行会有小幅波动。固定随机种子即可复现；如果某条通路在多次运行间时而显著时而不显著，说明它处于阈值边缘，不宜作为主要结论。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中，上传差异分析结果或表达矩阵并说明比较方向，Codar 会先确认排序指标、基因集来源和物种，再运行 GSEA；需要样本级评分时计算 ssGSEA 或 GSVA 分数。交付 GSEA 结果表、富集曲线图、leading edge 基因列表、基因集评分矩阵与热图、报告和可复现脚本。
我有人肺癌细胞系敲低 vs 对照各 3 个重复的 DESeq2 结果和表达矩阵，想用 Hallmark 做 GSEA，并算每个样本的 GSVA 评分画热图。
