免疫浸润分析（CIBERSORT、ESTIMATE）
免疫浸润分析是从 bulk 转录组表达谱中推断样本里各类免疫细胞和基质细胞的相对含量或富集程度，用来回答「肿瘤里 CD8+ T 细胞多不多」「高风险组是不是巨噬细胞更多」这类问题。方法大体分两类：一类是反卷积，把混合样本的表达看成多种细胞参考谱的加权和，如 CIBERSORT、EPIC、quanTIseq，输出细胞比例；另一类是基因集打分，如 xCell、MCP-counter、ESTIMATE 和基于 ssGSEA 的免疫细胞打分，输出在样本之间可比较的分数。典型数据是 TCGA、GEO 中的肿瘤 RNA-seq 或芯片表达矩阵，常与分子分型、风险评分、突变状态和免疫检查点表达联合分析。
什么时候用
- 比较高低风险组或不同分子亚型之间免疫细胞组成的差异
- 评估某个基因的表达与 CD8+ T 细胞、巨噬细胞等浸润水平的相关性
- 用免疫评分、基质评分刻画肿瘤微环境，区分冷肿瘤和热肿瘤
- 分析免疫浸润与 CD274（PD-L1）、CTLA4 等检查点基因表达的关联
- 没有单细胞数据时，在大样本 bulk 队列中初步估计免疫组成
不适合的情况
- 单细胞数据已能直接注释细胞类型，不需要再从混合信号反推
- 每组只有两三例样本，却想得出细胞比例显著不同的结论
- 把 xCell 或 ssGSEA 分数当作百分比，在不同细胞类型之间比大小
需要准备的数据
- 表达矩阵
- 基因为行、样本为列，用基因符号。CIBERSORT 需要非 log 的线性值，RNA-seq 建议用 TPM，不用原始计数。
- 分组或临床信息
- 分组、亚型、风险评分或生存数据，样本 ID 必须与表达矩阵列名一一对应。
- 参考签名或基因集
- CIBERSORT 常用 LM22（22 种免疫细胞）；ssGSEA 打分需准备各类免疫细胞的标志基因集。
- 检查点基因列表（可选）
- 如 CD274、PDCD1、CTLA4、LAG3、HAVCR2、TIGIT，用于与浸润结果或风险评分做相关分析。
分析步骤
- 1
整理表达矩阵
把探针或 Ensembl ID 转为基因符号，重复基因取均值或最大值，RNA-seq 换算为 TPM。检查参考签名中的基因有多少能在矩阵里找到，缺失比例过高时反卷积结果不可靠。
- 2
选择算法组合
需要细胞比例选 CIBERSORT、EPIC 或 quanTIseq；需要样本间可比的富集分数选 xCell、MCP-counter 或 ssGSEA；需要整体免疫和基质水平选 ESTIMATE。通常至少用两种原理不同的方法互相印证。
- 3
运行反卷积
CIBERSORT 设置置换次数，RNA-seq 数据关闭分位数标准化。运行后查看每个样本的反卷积 P 值和相关系数，P 值大于 0.05 的样本拟合不佳，常被剔除并在方法中说明。
- 4
ESTIMATE 评分
用 ESTIMATE 得到免疫评分、基质评分和总分。先确认评分与纯度呈预期的负相关，再按分组比较，或按中位数划分高低评分组，观察与分期、生存等临床特征的关系。
- 5
组间比较
对每种细胞做 Wilcoxon 或 Kruskal-Wallis 检验，并对多种细胞的 P 值做 BH 校正。用箱线图展示，比较的始终是同一种细胞在不同组之间的差异。
- 6
检查点关联
计算目标基因或风险评分与各类细胞浸润、检查点基因表达的 Spearman 相关，绘制相关热图。相关系数绝对值很小（如低于 0.2）时，即使 P 值显著也不宜过度解读。
- 7
交叉验证
对关键细胞类型比较不同算法给出的方向是否一致，必要时用免疫组化、流式或公开单细胞数据验证。只在一种算法中显著的结果应标为探索性发现。
关键参数与决策
CIBERSORT 置换次数（perm）
置换用于计算每个样本反卷积的经验 P 值，常用 100 到 1000 次。次数越多 P 值越稳定但耗时越长；设为 0 则不计算 P 值，无法按拟合质量筛选样本。
分位数标准化（QN）
CIBERSORT 对芯片数据通常开启，对 RNA-seq 建议关闭。RNA-seq 的表达分布与芯片差异较大，强行做分位数标准化会扭曲表达值，使细胞比例偏离。
相对模式与绝对模式
相对模式下各类细胞比例之和为 1，只反映组成；绝对模式得到的分数可在样本之间比较总量。想说明「免疫细胞整体变多」时，需要绝对模式或 ESTIMATE 免疫评分。
ESTIMATE 平台参数
platform 可选 affymetrix、agilent、illumina。肿瘤纯度的换算公式基于 Affymetrix 芯片建立，用于 RNA-seq 时免疫和基质评分仍可参考，纯度数值需谨慎解读。
参考谱的适用范围
LM22 基于血液来源的免疫细胞构建，不含肿瘤细胞和成纤维细胞。实体瘤中可配合 EPIC、quanTIseq 等考虑未知细胞成分的方法，或使用组织特异的参考谱。
高低分组阈值
可按中位数、四分位数或最佳截断值划分高低浸润组。最佳截断值依赖当前数据，容易过拟合，建议以中位数分组为主分析，最佳截断只作补充。
常见错误
- 把 log2 转换后的表达值直接输入 CIBERSORT：反卷积假设表达线性混合，log 尺度破坏加和关系，细胞比例会系统性偏移。
- 用 xCell 或 ssGSEA 分数比较不同细胞类型谁更多：这些分数只在同一细胞类型的样本之间可比，不同细胞类型的分数尺度不同。
- 不筛选 CIBERSORT 反卷积 P 值：拟合不佳样本的细胞比例不可信，混入后会削弱组间差异的可靠性，至少应报告筛选标准。
- 几十种细胞、多个算法反复检验却不做多重校正：大量比较中总会出现几个 P 小于 0.05 的结果，容易报告假阳性。
- 合并多个 GEO 数据集后不处理批次：数据集差异会被误读为免疫组成差异，合并前后都应用 PCA 检查样本是否按来源聚集。
- 把相关当因果：某基因与巨噬细胞浸润正相关，可能只是两者都随肿瘤纯度变化，可用偏相关校正纯度后再看。
结果怎么看
免疫细胞比例堆叠图
每根柱子是一个样本，颜色代表各类细胞的比例。主要看样本间组成差异和优势细胞类型；某类细胞在几乎所有样本中都为 0，多半是该细胞信号不足，不代表组织中真的没有。
组间比较箱线图
每种细胞在高低风险组或亚型间的分布及校正后 P 值。关注效应方向是否符合生物学预期，以及在不同算法中是否稳定；只有单一方法显著的结果证据较弱。
ESTIMATE 评分图
展示免疫评分、基质评分与肿瘤纯度。评分与纯度呈负相关是正常现象。若评分与生存相关，但在多因素模型中被分期抵消，说明它不是独立预后因素。
检查点相关热图
行为检查点基因，列为细胞类型或风险评分，格子显示 Spearman 相关系数和显著性。CD274 与 CD8+ T 细胞常同向变化；若方向普遍与常识相反，先检查基因名映射和分组方向。
和相近方法怎么选
CIBERSORT 与 xCell
CIBERSORT 用支持向量回归做反卷积，输出相对比例，以免疫细胞为主；xCell 基于基因集打分并做溢出校正，覆盖 64 种免疫与基质细胞，输出富集分数。需要比例时用 CIBERSORT，需要更多细胞类型并做样本间比较时用 xCell。
ESTIMATE 与细胞级方法
ESTIMATE 只给出免疫、基质整体评分和纯度估计，不区分细胞亚群，适合刻画冷热肿瘤或作为纯度协变量；想知道具体是哪类免疫细胞发生变化，需要 CIBERSORT、EPIC 等细胞级方法。
免疫浸润分析与 GSEA
免疫浸润估计的是细胞组成，GSEA 评估通路或基因集在组间是否整体上调。两者常搭配使用：GSEA 提示干扰素通路激活，再用浸润分析看是否伴随 T 细胞增多。
bulk 反卷积与单细胞注释
单细胞数据直接给出细胞类型和状态，分辨率高但样本量通常较小；bulk 反卷积可用于成百上千例公共队列。常见做法是用单细胞数据构建参考谱，再在大样本 bulk 队列中估计细胞组成。
常见问题
CIBERSORT 输入用 count、FPKM 还是 TPM？
不用原始 count。RNA-seq 建议用 TPM，FPKM 也能运行但样本间可比性较差，两者都应是非 log 的线性值。芯片数据用标准化后的表达值，若已做 log2 转换需先还原为线性尺度。RNA-seq 运行时通常关闭分位数标准化。
CIBERSORT 结果里很多细胞是 0 正常吗？
正常。CIBERSORT 的支持向量回归会把贡献很小的细胞系数压为 0，测序深度低或细胞本身稀少时更明显。应关注在多数样本中有可靠信号的细胞类型，不建议对大部分样本为 0 的细胞做组间比较。
免疫浸润分析用哪个算法最好？
没有单一最优算法，各方法的参考谱、输出含义和擅长的细胞类型不同。常见做法是用一个主方法给出主要结论，再用原理不同的方法验证关键细胞的方向。R 包 immunedeconv 集成了多种方法，便于在同一数据上统一比较。
ESTIMATE 免疫评分高说明什么？
免疫评分高表示样本中免疫细胞相关基因整体表达较高，基质评分高表示成纤维细胞等基质成分较多，ESTIMATE 总分越高推测的肿瘤纯度越低。它反映的是组成比例，不说明免疫细胞具有杀伤活性，需结合细胞毒性标志物和检查点表达判断。
免疫浸润结果能判断病人适不适合免疫治疗吗？
不能直接用于临床判断。这些结果是从表达谱推断的科研分析，可以用于提出假设或构建研究模型，不替代病理检测、PD-L1 检测或临床诊疗决策。与疗效相关的结论需要在有治疗和随访信息的独立队列中验证。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中说明数据来源和研究问题后，会先确认表达矩阵格式、分组信息和算法组合，再进行免疫浸润综合分析，估计各类免疫细胞组成并做组间比较；随后进行免疫评分与检查点关联分析，计算免疫与基质评分及其与常见检查点基因的相关性。交付细胞比例图、组间箱线图、相关热图、统计表、分析报告和可复现脚本。
我有 TCGA 肝癌 TPM 矩阵和风险高低分组，想用 CIBERSORT 和 ESTIMATE 比较两组免疫浸润及其与 PD-L1 的相关性。