空间解卷积（RCTD、cell2location）
Visium 等斑点级空间转录组的每个斑点混有多个细胞，测到的是它们表达的总和。解卷积借助一份已注释的单细胞或单核参考，估计每个斑点中各细胞类型的比例或绝对丰度，从而把斑点数据转化为细胞类型的空间分布图。常用方法有 RCTD（spacexr 包，显式建模平台效应）、cell2location（贝叶斯模型，估计细胞绝对数量）、CARD（利用空间相关性）、SPOTlight，以及 Tangram、CytoSPACE 这类把单个细胞映射到空间位置的方法。解卷积的上限取决于参考：参考中没有的细胞类型，在结果里也不会出现。
什么时候用
- Visium 数据中想知道免疫细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞在组织中的分布
- 比较不同空间域或不同病理区域中细胞类型组成的差异
- 寻找在空间上共定位的细胞类型组合，为细胞通讯假设提供位置证据
- 已有同组织单细胞数据，希望把单细胞亚群定位回组织切片
- 评估治疗前后某类细胞在特定区域的浸润程度变化
不适合的情况
- Xenium、CosMx 等已是单细胞分辨率的数据，应直接做细胞注释
- 没有同组织、同物种参考，只能用差异很大的组织充当参考
- 想区分参考中没有定义的细微状态，如同一亚型内的激活程度
需要准备的数据
- 空间表达原始计数
- 斑点级的原始 UMI 计数和坐标，RCTD 与 cell2location 都要求未标准化的整数计数。
- 单细胞参考数据
- 同组织、同物种的单细胞或单核原始计数及细胞类型注释；每个类型需有足够细胞，注释粒度与研究问题一致。
- 共享基因列表
- 参考与空间数据的基因名需统一；cell2location 教程建议先去除空间数据中的线粒体基因。
- 斑点细胞数先验
- cell2location 需要每个斑点预期细胞数，可参考 HE 图像上的核计数或组织学经验估计。
分析步骤
- 1
整理单细胞参考
对参考做质控，去掉双细胞和低质量细胞，确认注释可靠。细胞数特别少的类型考虑合并到上一级。参考应覆盖切片中可能出现的主要细胞类型，尤其不要遗漏肿瘤细胞或组织特有的实质细胞。
- 2
统一基因与过滤
取参考与空间数据的共有基因，过滤低表达和仅在极少细胞中出现的基因。共有基因数过少时检查物种和命名。cell2location 提供 filter_genes 函数按细胞比例和平均表达筛选参考基因。
- 3
估计参考表达特征
cell2location 先用 RegressionModel 在参考上估计每种细胞类型的表达特征，可把样本或技术作为批次变量校正；RCTD 由 Reference 对象内部计算各类型的平均表达谱。
- 4
运行解卷积
RCTD 用 create.RCTD 和 run.RCTD，Visium 常用 full 模式；cell2location 训练 Cell2location 模型。查看训练损失曲线是否收敛，未收敛时增加迭代次数。
- 5
检查结果合理性
把各细胞类型丰度画在组织图上，与 HE 形态和已知 marker 的空间表达对照。例如上皮丰度应集中在腺体区；某类型在全片均匀分布且数值都低，常提示参考不匹配。
- 6
共定位与区域比较
计算细胞类型丰度之间的空间相关性，或在 cell2location 中用 NMF 找共定位模块；按空间域汇总细胞组成，比较不同区域或组别之间的差异。
关键参数与决策
RCTD 模式（doublet_mode）
full 允许每个斑点含任意多种类型，适合 Visium 这类多细胞斑点；doublet 假设每个位置最多两种类型，适合 Slide-seq 等更小的捕获单元；multi 介于两者之间。
N_cells_per_location（cell2location）
每个斑点的预期细胞数，是重要的先验。应根据组织密度设置，可在 HE 上数几个斑点范围内的细胞核估计；设得过高会把丰度均摊到更多类型上。
detection_alpha（cell2location）
控制斑点间检测效率差异的正则化强度。教程建议在切片内技术差异大时使用较小值，如 20；差异小时可用较大值。斑点间测序深度很不均时尤其要关注。
参考注释粒度
粒度过粗会掩盖亚型的空间差异，过细则相近亚型表达特征难以区分，结果在亚型间来回分配。常见做法是先用大类跑一次确认合理，再细化关心的谱系。
常见错误
- 参考缺少切片中存在的细胞类型：缺失类型的信号会被分配给表达最相近的类型，造成后者在特定区域的虚假富集，例如肿瘤细胞被算作上皮细胞。
- 用标准化或对数转换后的数据作为输入：RCTD 和 cell2location 都基于计数模型，输入非计数数据会使似然计算失真，丰度估计偏差大。
- 把相对比例与绝对丰度混用：RCTD 的权重常归一为比例，cell2location 估计的是细胞数，两者跨斑点比较时含义不同，作图和统计前要说明用的是哪种。
- 参考来自单核测序而空间数据接近全细胞：两类数据对胞质转录本的捕获不同，部分细胞类型会被系统性高估或低估，可在模型中把平台差异作为批次考虑。
- 只看单个细胞类型的丰度图就下结论：解卷积存在类型间的相互替代，应同时检查相近类型的分布和 marker 基因的原始空间表达。
结果怎么看
细胞类型丰度空间图
每种细胞类型一张组织图，颜色表示比例或估计细胞数。看分布是否与形态相符，例如 B 细胞是否集中在淋巴滤泡。cell2location 常用后验分布的 5% 分位数作为保守估计。
饼图式组成图
每个斑点画一个小饼图显示主要细胞类型的比例，适合在局部放大区域展示混合程度。斑点多时整体图会难以辨认，应只展示感兴趣区域。
共定位分析图
用细胞类型丰度间的相关矩阵或 NMF 模块展示哪些类型倾向于出现在同一位置。强正相关提示可能的生态位；需排除两者都只在高细胞密度区升高造成的相关。
分区组成统计表
按空间域或病理区域汇总各细胞类型的平均比例。组间比较应以样本为单位，而不是把所有斑点当作独立观测，否则 P 值会被严重低估。
和相近方法怎么选
RCTD 与 cell2location
RCTD 速度较快，显式估计参考与空间数据之间的平台效应，输出比例，适合快速得到可靠的组成；cell2location 是贝叶斯层次模型，估计绝对细胞数并能在参考中校正批次，计算量更大，通常需要 GPU 加速。
解卷积与细胞映射
解卷积回答每个斑点由哪些类型构成；Tangram、CytoSPACE 等映射方法把单个参考细胞分配到空间位置，可得到带单细胞表达的虚拟空间数据。只要组成时用解卷积，要把细胞状态细节放回组织时考虑映射。
空间解卷积与 bulk 免疫浸润估计
两者都在估计混合样本的细胞组成。CIBERSORT 等针对整块组织的 bulk 表达，只给一个样本一组比例；空间解卷积针对每个斑点，保留位置信息，但需要匹配的单细胞参考，且每个斑点计数更稀疏。
常见问题
解卷积一定要有自己的单细胞数据吗？
不一定，可以使用公共的同组织、同物种单细胞图谱作为参考。关键是参考要覆盖切片中的主要细胞类型，且组织状态接近，例如肿瘤切片最好使用肿瘤而非正常组织的参考，否则肿瘤细胞会缺失。
cell2location 的 N_cells_per_location 怎么设？
根据组织的细胞密度估计：在 HE 图像上数若干个斑点范围内的细胞核，取典型值。不同组织差异较大，同一切片中也有疏密区域，这个值作为先验而非硬约束，取大致合理的量级即可。
解卷积结果怎么验证？
可用以下方式交叉核对：已知 marker 基因的原始空间表达是否与对应类型丰度一致；结果是否与 HE 形态或免疫组化相符；换用另一种方法或另一份参考，主要细胞类型的分布是否稳定。
Visium HD 还需要解卷积吗？
8 µm 分箱已接近单细胞尺度，但一个分箱仍可能跨越两个细胞的边界，部分方法如 RCTD 也被用于 HD 数据。较大分箱仍存在混合，较小分箱则计数稀疏，常见做法是结合细胞分割后再注释。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明空间数据和单细胞参考的位置，以及参考中细胞类型注释所在的列。Codar 会先确认方案，包括参考如何整理、采用哪种解卷积或细胞映射方法、关键先验如何设定，然后运行空间转录组解卷积与细胞映射，交付各细胞类型的空间丰度图、斑点组成表、共定位分析结果，以及分析报告和可复现脚本。
我有乳腺癌 Visium 切片和同一批患者的单细胞注释数据，想估计每个斑点里肿瘤细胞、CAF 和 T 细胞的比例，看它们在空间上怎么分布。