Olink 与亲和蛋白组分析（NPX）
亲和蛋白组不用质谱，而是用特异结合分子识别目标蛋白。Olink 采用邻位延伸技术（PEA）：一对抗体各带一段寡核苷酸，两者同时结合同一蛋白时寡核苷酸靠近并延伸成 DNA 条形码，再用 qPCR 或测序读出，结果以 NPX 表示。SomaScan 则用修饰的核酸适配体（SOMAmer）结合蛋白，读出为相对荧光单位 RFU。这类平台只需少量血浆或血清就能测数百到数千种蛋白，适合大样本队列，但测的是事先设计好的蛋白，读数为相对量，并受结合表位影响。相关分析属于科研用途，不替代临床诊断。
什么时候用
- 数百到上千例血浆或血清队列中筛选与疾病或结局相关的蛋白
- 炎症、心血管、肿瘤等主题 panel 上做病例-对照比较
- 与基因型数据结合做 pQTL 分析，为孟德尔随机化提供工具变量
- 构建蛋白组衰老时钟或风险预测模型的特征来源
- 样本量少、体积小的珍贵样本，如脑脊液或婴儿血样
不适合的情况
- 寻找 panel 以外的新蛋白或修饰形式：只能测预先设计的靶标
- 需要蛋白绝对浓度：NPX 和 RFU 是相对量，不同蛋白之间不可直接比较大小
- 细胞或组织裂解液的全面蛋白组表征：质谱覆盖更广且无需预设靶标
需要准备的数据
- NPX 数据文件
- Olink 交付的 NPX 表，含 SampleID、Assay、UniProt、PlateID、QC_Warning、LOD 等列
- 样本信息表
- 分组、年龄、性别、采血时间、样本类型和冻融次数；溶血、脂血等样本状态也应记录
- 桥接样本列表
- 多批次或多项目时，同时出现在不同批次中的相同样本 ID，用于批次间归一化
- SomaScan adat 文件（如有）
- 包含 RFU 和 SomaLogic 标准化标记；需确认使用的是哪一步归一化后的数据
分析步骤
- 1
读取与整理数据
用 OlinkAnalyze 的 read_NPX 读入数据，检查样本数、蛋白数和 panel 是否与项目一致。对照品和空白孔应与真实样本分开，不参与后续统计。
- 2
样本质控
查看 QC_Warning 标记的样本。Olink 根据每个样本内部对照的偏离程度给出警告，常见原因是溶血或加样问题。再用 PCA 和每个样本 NPX 中位数与四分位距识别离群样本。
- 3
LOD 处理
统计每个蛋白低于 LOD 的样本比例。大部分样本低于 LOD 的蛋白定量不可靠，常见做法是排除或在结果中标注；少量低于 LOD 的值通常保留原始 NPX，不简单替换为 LOD。
- 4
批次桥接归一化
多板或多批次数据，用桥接样本计算每个蛋白在两批之间的中位数差异，对其中一批整体平移，即 olink_normalization 中的 bridge 方式。归一化后画 PCA，按批次聚类的现象应明显减弱。
- 5
差异分析
NPX 已是 log2 尺度，可直接用 t 检验、方差分析或线性模型，纳入年龄、性别、肾功能等协变量。OlinkAnalyze 提供 olink_ttest、olink_anova、olink_lmer 等函数，结果做 FDR 校正。
- 6
结果解读与验证
对显著蛋白查看其 LOD 比例、组内分布和协变量敏感性，再做通路富集。候选标志物应在独立队列或另一平台上复测，评估诊断性能时改用 ROC 等方法。
关键参数与决策
LOD 比例阈值
排除低于 LOD 比例过高的蛋白可减少噪音，阈值常在一半样本左右取舍。若某蛋白只在病例中可检出，排除会丢失真实信号，此时可改用检出与否的二分类分析。
归一化方式
同一项目内的多板数据，Olink 通常已做板内对照归一化或强度归一化；跨项目合并时需要桥接样本。桥接样本数越多估计越稳定，应覆盖各蛋白的表达范围。
协变量选择
血浆蛋白受年龄、性别、BMI 和肾功能影响明显，很多小分子量蛋白随肾小球滤过率下降而升高。病例与对照在这些变量上不平衡时必须校正。
多重检验口径
FDR 校正应覆盖实际检验的全部蛋白。多个 panel 一起分析时，各 panel 中重复测定的蛋白需要去重或明确选择其中一个结果，避免重复计入。
常见错误
- 直接比较不同蛋白的 NPX 大小：NPX 是各蛋白各自的相对尺度，某蛋白 NPX 更高不代表其浓度更高。
- 不同批次未做桥接就合并：NPX 在批次间存在整体平移，合并后的差异可能完全来自批次。
- 把 NPX 当作线性尺度再取对数：NPX 已是 log2 尺度，再次取对数会扭曲分布，倍数变化应以 2 的 NPX 差值次方计算。
- 忽视样本前处理：溶血、反复冻融和处理时长会改变部分蛋白读数，病例和对照处理方式不一致时会产生系统偏差。
- 把 pQTL 结果直接视为蛋白水平的遗传调控：改变蛋白序列的变异可能只影响抗体或适配体的结合表位，造成假的 cis-pQTL。
结果怎么看
样本质控 PCA 与离群图
PCA 中远离主体的样本，结合 NPX 中位数与四分位距图判断是否为离群。离群样本集中在某一板，提示该板加样或运输问题；与 QC_Warning 一致时可放心剔除。
LOD 比例图
按蛋白列出低于 LOD 的样本比例。比例接近 100% 的蛋白在样本类型中基本不可测；病例组和对照组 LOD 比例差别很大时，这种差异本身可能就是信号。
差异蛋白火山图
横轴为组间 NPX 差值，即 log2 倍数变化，纵轴为 -log10(调整后 P)。注意标注 LOD 比例高的蛋白，它们的差值可能由少数可检出样本驱动，需要结合箱线图核对。
单蛋白箱线图
展示显著蛋白在各组中的 NPX 分布，并画出 LOD 线。点大多落在 LOD 线以下时，组间差异解释需谨慎；组内分布呈明显双峰时，检查是否与批次或性别相关。
和相近方法怎么选
Olink 与 SomaScan
Olink 依赖一对抗体同时结合，特异性高，读数为 NPX；SomaScan 用单个适配体，覆盖蛋白数更多，读数为 RFU。两平台对同名蛋白的相关性因蛋白而异，部分蛋白相关很低，跨平台比较或复现时需逐个检查。
亲和蛋白组与质谱蛋白组
质谱无需预设靶标，可发现新蛋白和修饰，但血浆中高丰度蛋白掩盖低丰度信号。亲和平台通量高、对低丰度细胞因子敏感，但只测设计内的蛋白且受表位影响。发现阶段与验证阶段常组合使用。
Olink 与传统 ELISA
ELISA 一次测一个蛋白，能给出绝对浓度，适合少量蛋白的临床检测和验证。Olink 一次测几十到上千个蛋白，只给相对量。用 ELISA 验证 Olink 结果时应比较相关性和组间差异方向，而非数值大小。
常见问题
NPX 是什么意思？
NPX（Normalized Protein eXpression）是 Olink 的相对定量单位，为 log2 尺度。NPX 增加 1 表示蛋白量约翻倍。它只能在同一蛋白的不同样本之间比较，不能比较不同蛋白，也不是浓度单位。
低于 LOD 的 NPX 值要不要删除？
通常不建议逐个删除或替换为 LOD。低于 LOD 的值虽然精度较低，但仍保留相对排序信息，删除会造成选择性缺失。更常见的做法是对 LOD 比例很高的蛋白整体排除或标注，并在敏感性分析中比较不同处理的结果。
两个 Olink 项目的数据怎么合并？
需要在两个项目中包含相同的桥接样本，按蛋白计算桥接样本在两批之间 NPX 的中位数差异，用来平移其中一批。OlinkAnalyze 的 olink_normalization 支持这种方式。没有桥接样本时，只能分别分析后做荟萃合并。
Olink 差异分析用什么统计方法？
NPX 是 log2 尺度、近似正态，常用 t 检验、方差分析或线性模型，并纳入年龄、性别等协变量；有重复测量时用线性混合模型。全部蛋白统一做 FDR 校正。分布偏态明显的蛋白可用 Wilcoxon 检验作为敏感性分析。
Olink 数据能用来做孟德尔随机化吗？
可以。常见做法是用与该蛋白编码基因邻近的 cis-pQTL 作为工具变量，估计血浆蛋白水平对疾病的因果效应，并配合共定位分析排除连锁干扰。需要警惕改变蛋白序列的变异只影响抗体结合而不改变真实蛋白量。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 Olink NPX 文件或 SomaScan 数据及样本信息后，会先确认 panel、批次结构、LOD 处理方式和协变量，再进行亲和蛋白质组分析：样本质控与离群检测、批次间归一化、带协变量的差异蛋白统计和通路富集。交付质控图、归一化数据表、火山图和箱线图、报告和可复现脚本。
我有 600 例血浆样本的 Olink Explore 3072 NPX 数据，分两批测定并有 16 个桥接样本，想做批次归一化并找出与心衰相关的蛋白