孟德尔随机化（MR）分析
孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）用与暴露相关的遗传变异作为工具变量，估计暴露对结局的因果效应。等位基因在配子形成时随机分配，且先于疾病发生，因此在满足假设时，遗传变异与结局的关联可以避开常见的混杂和反向因果。最常见的是两样本 MR：暴露和结局各取一份公开的 GWAS 汇总统计，不需要个体数据。典型问题如「BMI 升高是否增加冠心病风险」「某个血浆蛋白水平是否影响某种癌症」。MR 的可信度完全取决于工具变量是否满足三条核心假设，所以敏感性分析和多效性评估与主分析同样重要。
什么时候用
- 观察性研究发现暴露与疾病相关，想排除混杂和反向因果的干扰
- 暴露和结局都有大样本 GWAS 汇总统计，且来自相近祖源人群
- 评估血浆蛋白、代谢物或基因表达作为药物靶点的潜在因果作用
- 检验两个性状间的因果方向，做双向 MR
- 多个相关暴露需要分离各自独立效应，做多变量 MR
不适合的情况
- 暴露缺乏稳健的遗传工具，或只能找到弱工具变量（F 统计量偏低）
- 暴露与结局 GWAS 来自不同祖源人群，LD 和效应量不可比
- 想估计短期干预或某一时点暴露的效应：MR 估计的是终生遗传差异的平均影响
需要准备的数据
- 暴露 GWAS 汇总统计
- 需含 SNP、效应等位基因、其他等位基因、BETA、SE、P 和 EAF；二分类暴露的 BETA 为 log(OR)
- 结局 GWAS 汇总统计
- 字段同上；与暴露 GWAS 的基因组版本、祖源一致，样本尽量不重叠
- LD 参考面板
- 用于工具变量 clump 和寻找替代 SNP，常用 1000 Genomes 中与研究人群相同祖源的样本
- 样本信息
- 两份 GWAS 的样本量、病例数和人群来源，用于计算 F 统计量、评估样本重叠和解释效应单位
分析步骤
- 1
确定研究问题
写清暴露、结局、人群和效应单位，例如每增加 1 个标准差 BMI 对冠心病风险的 OR。提前定好主分析方法和敏感性分析，避免看结果后再挑方法。同时确认两份 GWAS 的祖源一致、样本尽量不重叠，这两点直接决定后续估计是否可信。
- 2
筛选工具变量
从暴露 GWAS 中取 P 小于 5e-8 的 SNP，按 LD 做 clump，TwoSampleMR 的默认设置是 r² 0.001、窗口 10000 kb。显著位点太少时可放宽到 5e-6 等阈值，但需说明并做相应敏感性分析。最终保留的工具变量数量要记录下来，它影响后续异质性检验的效力。
- 3
评估工具强度
对每个 SNP 计算 F 统计量（常用 β²/SE² 近似），经验上 F 大于 10 视为非弱工具。弱工具在两样本无重叠时使结果偏向零，在样本重叠时偏向观察性估计。还可报告全部工具变量合计解释的暴露方差比例，它决定这次分析能检出多小的效应。
- 4
提取并协调等位基因
在结局 GWAS 中提取同一批 SNP，缺失时找 r² 高（常用大于 0.8）的替代 SNP。将两份数据的效应等位基因对齐，回文 SNP（A/T、C/G）借助等位基因频率推断链方向，频率接近 0.5 的直接剔除。
- 5
主分析
工具变量多于一个时以 IVW 为主分析；只有一个 SNP 时用 Wald 比值。异质性较大时可改用随机效应 IVW。效应方向与观察性研究一致只是旁证，最终要看敏感性分析是否同向。
- 6
敏感性分析
补充 MR-Egger、加权中位数、加权众数；用 Cochran Q 检验异质性，用 MR-Egger 截距检验方向性多效性，用 MR-PRESSO 识别离群 SNP，再做逐一剔除分析。各方法方向一致、置信区间相近才算结果稳健。
- 7
方向与报告
用 Steiger 检验确认工具变量解释暴露的方差大于解释结局的方差。必要时做反向 MR。报告时可参考 STROBE-MR 清单，列出工具变量表、各方法估计和全部敏感性分析结果。
关键参数与决策
工具变量 P 值阈值
默认 5e-8，保证与暴露的关联足够稳健。暴露 GWAS 样本小、显著位点不足 3 个时有人放宽到 5e-6 或 1e-5，但弱工具风险上升，需报告 F 统计量并与严格阈值结果对比。
clump 的 r² 与窗口
两样本 MR 多数方法假设工具变量相互独立，常用 r² 0.001、窗口 10000 kb。若想保留更多相关 SNP，需改用能处理 LD 相关矩阵的方法，并提供与研究人群匹配的 LD 矩阵。
回文 SNP 处理
TwoSampleMR 的 harmonise_data 中 action=2 会用等位基因频率推断回文 SNP 的链方向，频率接近 0.5 时无法判断而被剔除；action=3 则直接剔除全部回文 SNP，更保守。
主分析模型
固定效应 IVW 假设所有工具变量估计同一个真值；Cochran Q 显著时用乘法随机效应 IVW，置信区间会变宽。工具变量中有大量多效性 SNP 时，加权中位数在一半以上权重有效时仍一致。
常见错误
- 暴露和结局来自同一队列（如都来自 UK Biobank）：样本重叠加上弱工具会让估计偏向观察性关联，降低了 MR 本应提供的校正。
- 等位基因没有对齐：效应等位基因在两份数据中不一致时，部分 SNP 的方向被反转，IVW 估计被拉向零甚至反号。
- 只报 IVW 显著就下因果结论：IVW 对水平多效性敏感，MR-Egger 截距显著或加权中位数方向相反时，主结论需要降级。
- 把 MR-Egger 截距不显著当作没有多效性：截距检验只针对方向性多效性，工具变量少时效力很低，相互抵消的平衡多效性也查不出来，还需结合漏斗图和逐一剔除结果一起判断。
- 工具变量本身与结局 GWAS 中的混杂相关性状强关联，例如用 BMI 工具研究某病却未考虑吸烟、教育等通路，违反排他性假设。
- 混淆效应单位：二分类暴露的 MR 估计对应每增加 1 个 log-odds 遗传易感性的效应，直接解释成患病与否的效应会夸大结论。
结果怎么看
MR 结果汇总表
每行一种方法，列出 SNP 数、β 或 OR、95% 置信区间和 P 值。重点看 IVW 是否显著，以及 MR-Egger、加权中位数、加权众数的方向是否一致。方向互相矛盾，或只有 IVW 显著而其余方法置信区间都跨过零，说明结论不稳，需要降级表述。
散点图
横轴为 SNP 对暴露的效应，纵轴为对结局的效应，各方法的斜率即因果估计。点大致沿 IVW 直线分布较好；少数远离直线的点可能是多效性 SNP，MR-Egger 线截距明显偏离零也提示方向性多效性。
森林图与漏斗图
森林图展示每个 SNP 的 Wald 比值及合并估计，看结果是否被少数 SNP 主导，某个点的估计远离其余点时应单独核查该位点的功能注释。漏斗图以估计精度为纵轴，点左右大致对称说明多效性较平衡，明显偏向一侧提示方向性多效性。
逐一剔除图
每次去掉一个 SNP 重算 IVW。去掉某个 SNP 后结果由显著变为不显著，说明结论依赖这个位点，应检查它是否位于多效性基因区，例如与血脂、阿尔茨海默病等多种性状相关的 APOE 区域。
和相近方法怎么选
MR 与共定位分析
MR 用多个工具变量估计暴露对结局的整体效应大小和方向；共定位只看单个区域内两个性状是否共享同一个因果变异。用 cis-eQTL 或 pQTL 做单基因 MR 时，常再做共定位排除 LD 引起的假关联，两者互为补充。
IVW、MR-Egger 与加权中位数
IVW 效力最高，但要求全部工具有效或多效性平衡。MR-Egger 允许方向性多效性，代价是置信区间很宽。加权中位数在超过一半权重来自有效工具时一致。三者结果一致比单看哪个更显著更有说服力。
两样本 MR 与单样本 MR
单样本 MR 在同一批个体中有暴露、结局和基因型，常用两阶段最小二乘法，弱工具偏倚偏向观察性估计。两样本 MR 只需汇总统计，样本量大，但要保证两份数据来自同一人群且重叠少。
常见问题
孟德尔随机化的三个核心假设是什么？
相关性：工具变量与暴露稳健相关；独立性：工具变量与暴露-结局的混杂因素无关；排他性：工具变量只通过暴露影响结局，不存在其他通路。第一条可以用 F 统计量检验，后两条无法直接证明，只能靠多效性检验和多种敏感性分析间接评估。
F 统计量小于 10 怎么办？
先剔除 F 低于 10 的单个 SNP，再看合并 F 值。若整体工具都偏弱，可尝试更大的暴露 GWAS、改用两样本且无重叠的数据，或在报告中明确说明弱工具偏倚的方向。不建议靠放宽 P 值阈值硬凑 SNP 数量。
MR 结果 IVW 显著但 MR-Egger 不显著，可以发表吗？
MR-Egger 置信区间本来就宽，不显著但方向一致时一般可以接受。关键是 Egger 截距是否显著、加权中位数和众数方向是否一致、逐一剔除是否稳定。如果 Egger 方向相反且截距显著，主结论需要谨慎表述。
两样本 MR 的数据去哪里找？
常用来源包括 IEU OpenGWAS、GWAS Catalog 的完整汇总统计、FinnGen 公开结果、UK Biobank 相关的批量 GWAS，以及 eQTLGen、GTEx 等 QTL 数据。下载后先确认基因组版本、效应等位基因和样本量字段，再做标准化。同时记录人群构成，用于判断样本是否重叠。
MR 能证明因果关系吗？
MR 提供的是在假设成立前提下的因果证据，强于普通观察性关联，但假设本身无法完全检验。论文中通常表述为「支持某暴露与结局之间存在因果关联」，并与随机对照试验、实验研究等其他证据结合讨论。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里给出暴露和结局（可以是公开 GWAS 编号或本地汇总统计文件）后，会先确认分析方案，对两份汇总统计做质控和格式标准化，统一效应等位基因与基因组版本，再进行孟德尔随机化因果分析：工具变量筛选与强度评估、等位基因协调、IVW 主分析及 MR-Egger、加权中位数、异质性、多效性和逐一剔除等敏感性分析。交付结果表、散点图、森林图、漏斗图、报告和可复现脚本。
我想用两样本孟德尔随机化看 LDL 胆固醇对冠心病的因果效应，暴露和结局都用欧洲人群公开 GWAS，需要完整敏感性分析