群体结构与祖源分析（PCA、ADMIXTURE）
群体结构分析研究一批个体或群体之间的遗传关系：谁和谁更相近，分成几个遗传簇，每个个体的祖源由哪几部分构成。常用三类方法互相补充：主成分分析（PCA）把高维基因型压缩到几个轴上直观展示分化；ADMIXTURE 等模型法在给定 K 个祖源群体的假设下估计每个个体的混合比例；系统发育树从距离或序列出发重建亲缘关系。数据通常是全基因组 SNP，来自芯片、重测序或简化基因组测序，研究对象可以是人群，也可以是作物品种、家畜和病原体。在 GWAS 中，群体结构分析还是控制分层偏倚的前置步骤。
什么时候用
- GWAS 前识别祖源离群样本，确定纳入多少个主成分作为协变量
- 作物、家畜或野生物种重测序后，研究品种或地理群体的遗传分化
- 估计混合群体中各祖源成分的比例
- 病原体或物种样本构建系统发育树，研究进化关系与传播
- 比较群体间的分化程度，筛选高 Fst 的候选选择区域
不适合的情况
- 只有少量位点（如几十个微卫星）又想做精细的混合比例估计
- 把 ADMIXTURE 的 K 个成分直接解释为历史上真实存在的祖先群体
- 存在大量近亲个体却不处理：PCA 和 ADMIXTURE 会被家系结构主导
需要准备的数据
- 基因型数据
- VCF 或 PLINK 格式的二等位 SNP；完成样本和位点质控，剔除高缺失位点
- 样本信息表
- 个体 ID 与群体、地理来源或品种的对应关系，用于给图着色和按群体计算统计量
- 参考群体（可选）
- 人类研究常加入 1000 Genomes 等参考样本做投影，用于判断研究样本的大致祖源
- 建树序列或比对（建树时）
- 多序列比对文件或由 SNP 拼接的比对；需注明是否只含变异位点，这关系到模型校正
分析步骤
- 1
质控与亲缘过滤
剔除高缺失样本和位点、低 MAF 位点，只保留二等位 SNP。用 KING 等工具估计亲缘系数，近亲对只保留一人，否则 PCA 的前几个轴可能只反映某个家系的结构。同时核对样本标签与分组信息，标签错误在后续图上很难发现。
- 2
LD 剪枝
用 PLINK --indep-pairwise 剪除高 LD 位点，常用设置为窗口 50 个 SNP、步长 5、r² 0.2。人类数据还常排除 MHC 等长程 LD 区域和已知大片段倒位区，避免某一个区域主导主成分，使轴反映的是局部 LD 而不是群体分化。
- 3
主成分分析
用 PLINK --pca 或 EIGENSOFT 的 smartpca 计算主成分，查看各主成分解释的方差比例。只有研究样本与参考样本合并分析时，才能把研究样本放到参考群体的坐标系中解读。
- 4
ADMIXTURE 祖源分析
在剪枝后的 bed 文件上，对 K 从 2 到若干依次运行 ADMIXTURE 并加 --cv 得到交叉验证误差。每个 K 用多个随机种子重复，选误差较低且多次运行结果一致的 K，再用 CLUMPAK 等工具把不同运行的成分对齐后作图。
- 5
群体分化统计
按群体计算 Fst（如 VCFtools 的 --weir-fst-pop 或 PLINK 2 的 --fst），了解群体两两之间的分化程度。也可沿基因组滑窗计算 Fst，寻找分化异常高的区域作为候选选择信号，滑窗大小需结合物种的 LD 衰减尺度确定。
- 6
系统发育树构建
根据数据类型选方法：距离法（如邻接法）速度快，适合大量样本的快速浏览；最大似然法（IQ-TREE、RAxML-NG）更准确。用 ModelFinder 等选择替代模型，用 bootstrap 评估分支支持度，再用 iTOL 或 ggtree 可视化并标注群体信息。
- 7
结果整合
把 PCA、ADMIXTURE 和进化树放在一起解读：三者给出的分组应大体一致。出现矛盾时，先检查样本标签、质控和建树所用位点，而不是挑一个看起来最好的结果。
关键参数与决策
LD 剪枝阈值
r² 0.2 是常用起点，数据位点很多时可更严格（如 0.1）以减少计算量。剪枝不足时 PCA 会出现由单个 LD 区块驱动的轴，ADMIXTURE 也会把高 LD 区域当成独立信息过度计权。
ADMIXTURE 的 K 值
以交叉验证误差最低或下降趋于平缓的 K 为参考，但不应只报一个 K。通常同时展示相邻多个 K 的结果，说明随 K 增加哪些群体先被分开，这比单一最佳 K 更有信息量。
主成分个数
用于 GWAS 校正时常取前 10 个左右，也可看碎石图或 Tracy-Widom 检验（smartpca 提供）判断有统计意义的主成分数。用于展示时一般画前两到三个主成分。
建树模型与支持度
只用变异位点建树时需做 ascertainment bias 校正（IQ-TREE 中在模型后加 +ASC）。支持度方面，标准 bootstrap 常以 70 以上为较可靠，IQ-TREE 的 UFBoot 通常要求 95 以上才视为可靠。
常见错误
- 不剪枝就做 PCA 或 ADMIXTURE：结果被少数高 LD 区域或大片段倒位区主导，出现与群体分化无关的主成分轴，祖源比例也会把同一区域的信息重复计入。
- 研究样本单独做 PCA 后与参考群体的图直接对比：两次分析得到的坐标系不同，轴的方向和符号都可能不一致，应把研究样本与参考样本合并计算，或做投影分析。
- 样本量严重不均衡：某个群体样本特别多时，PCA 前几个轴会围绕它展开，小群体被压缩在一起，可以按群体下采样后比较。
- ADMIXTURE 只跑一次：不同随机种子可能收敛到不同局部最优，结果不稳定却被当成结论，应多次运行并用 CLUMPAK 等工具对齐。
- 把 ADMIXTURE 中的混合比例当成发生过混合的证据：连续的地理梯度或瓶颈效应也会产生类似模式，需要 f 统计量等方法进一步检验。
- 用低支持度的分支讨论进化关系：bootstrap 很低的节点在不同数据子集或不同模型下可能重新排列，基于这类节点推断分化顺序或迁移路线，结论无法重复。
结果怎么看
PCA 散点图
每个点是一个个体，按群体着色。看各群体是否分开、沿哪条轴分开，以及轴解释的方差比例。个别个体落在其他群体中，可能是标签错误、样本污染或真实的迁移个体，需要回查。
ADMIXTURE 柱状图
每根竖条是一个个体，不同颜色代表 K 个成分的比例，个体按群体排列。看随 K 增加哪些群体先分出来，以及群体内部是否一致。同一群体内比例差异大，提示存在亚结构或混合。
交叉验证误差图
横轴为 K，纵轴为交叉验证误差。最低点或曲线开始变平的拐点是选择 K 的参考。曲线持续下降且没有明显拐点，说明结构是连续的或样本量不足以分辨更多成分，这时不宜只报一个 K，应展示相邻几个 K 的结果。
系统发育树
看样本是否按群体或地理来源聚为单系，以及节点支持度。长枝可能是测序质量差或高度分化的样本；同一群体分散在多个分支，可能存在基因流或标签问题。
和相近方法怎么选
PCA 与 ADMIXTURE
PCA 不依赖模型，快速展示主要分化方向，适合质控和 GWAS 协变量。ADMIXTURE 基于混合模型，给出每个个体的祖源比例，更直观但依赖 K 的选择和模型假设。两者一般同时做，结果相互印证。
ADMIXTURE 与 STRUCTURE、fastSTRUCTURE
三者模型思路相近，都是在给定 K 的前提下估计混合比例。STRUCTURE 用 MCMC 采样，可处理多种标记类型，但在全基因组 SNP 数据上很慢；ADMIXTURE 用最大似然优化，速度快，适合大量 SNP；fastSTRUCTURE 用变分推断，同样适合大规模数据。
距离法建树与最大似然建树
邻接法等距离法基于遗传距离矩阵，计算快，适合上百个样本的快速浏览和质控。最大似然法直接对序列演化建模，可以比较替代模型、评估分支支持度，更适合用于发表的进化关系推断，代价是计算量大，样本很多时需要较长时间。
常见问题
ADMIXTURE 的最佳 K 值怎么选？
对一系列 K 加 --cv 运行，选交叉验证误差最低或下降开始变缓的 K。同时要结合生物学背景和多次运行的一致性。论文中常展示多个 K 的结果，把最佳 K 作为重点解释，而不是只放一张图。
PCA 图上样本分不开说明什么？
可能是群体间确实分化很弱，也可能是位点太少或剪枝过度。可以检查前几个主成分解释的方差，并看后面的主成分是否能分开。分化很弱时，用 Fst 或 ADMIXTURE 在较高 K 上也许能看到细微结构。
SNP 数据怎么构建系统发育树？
常见做法有两种：用 PLINK 计算个体间的遗传距离，再做邻接树，速度快；或把 SNP 转成比对格式后用 IQ-TREE 做最大似然树。后者因为只包含变异位点，需要加 ascertainment bias 校正，否则分支长度会被系统性高估。
Fst 多大算高度分化？
常被引用的经验划分是 0 到 0.05 分化很小，0.05 到 0.15 中等，0.15 到 0.25 较大，0.25 以上很大。这只是粗略参考，具体解释要结合物种、标记类型和样本量，不同估计方法得到的数值也不完全可比。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 VCF 或 PLINK 基因型和样本分组信息后，会先确认分析方案，再进行群体结构与祖源分析：质控与 LD 剪枝、主成分分析、多个 K 值的祖源比例估计与交叉验证、群体间分化统计；需要时进一步做系统发育树构建与评估，包括模型选择和分支支持度。交付 PCA 图、祖源柱状图、CV 误差图、进化树图、统计表、报告和可复现脚本。
我有 120 个水稻品种的重测序 VCF 和品种来源表，想做 PCA 和 ADMIXTURE（K=2 到 8），再建一棵最大似然树看品种间关系