WES/WGS 胚系变异检测：GATK 最佳实践
胚系变异是个体从父母遗传、存在于全身细胞中的变异，杂合位点的等位基因比例约为 50%，纯合约为 100%。全外显子组测序（WES）捕获编码区，适合遗传病和家系研究；全基因组测序（WGS）覆盖更均匀，能检出非编码区变异和更多变异类型。GATK 最佳实践是检测胚系 SNV 和小 Indel 最常用的参考流程：比对、标记重复、碱基质量校准、逐样本生成 GVCF、多样本联合分型，最后做变异质量过滤。输入通常是双端 FASTQ，输出是过滤后的多样本 VCF，供后续注释、致病性评估或群体遗传分析使用。
什么时候用
- 罕见病先证者及家系成员的外显子组测序分析
- 队列 WES 或 WGS 数据批量检测胚系 SNV 和 Indel
- 为 ACMG 分类、关联分析或群体遗传分析准备高质量 VCF
- 用肿瘤患者的正常血样检测胚系易感突变
- 把从公共数据库下载的测序数据用统一流程重新分析
不适合的情况
- 肿瘤组织中的体细胞突变：低频突变需用 Mutect2 等体细胞流程和配对正常样本
- 大片段缺失、重复和倒位：HaplotypeCaller 主要检测小变异，需专门的结构变异工具
- 高度同源区域（如 SMN1 与 SMN2）的变异：短读长无法唯一比对，需要专门方法
需要准备的数据
- 双端 FASTQ
- 每个样本一对文件，比对时需写入 read group（样本名、文库、测序批次），后续步骤靠它区分样本
- 参考基因组
- 推荐 GRCh38，配套 .fai、.dict 和 BWA 索引；染色体命名（chr1 或 1）要与已知位点文件一致
- 已知变异资源
- dbSNP、Mills 与 1000G 金标准 Indel 等，用于 BQSR 和 VQSR，版本必须与参考基因组一致
- 捕获区间文件（WES）
- 试剂盒对应的 BED 或 interval list，坐标版本与参考一致，用于限定检测区域和计算覆盖度
- 样本信息
- 性别、家系关系和表型，用于核对推断性别与亲缘关系，以及后续按遗传模式筛选
分析步骤
- 1
原始数据质控
用 FastQC 查看碱基质量、接头污染和 GC 分布，必要时用 fastp 去接头和低质量末端。各样本数据量和 Q30 比例应接近，个别样本显著偏低需评估是否重测。
- 2
比对与排序
用 BWA-MEM 比对到参考基因组，写入 read group 后按坐标排序并建索引。人类样本比对率通常很高，明显偏低提示物种污染、接头残留或参考版本用错。
- 3
标记重复
用 MarkDuplicates 标记 PCR 和光学重复，下游检测会忽略这些 reads。WES 的重复率通常高于 WGS；重复率过高说明文库复杂度不足，有效深度会明显低于名义深度。
- 4
碱基质量校准
BaseRecalibrator 以已知变异位点为掩码，建模测序仪的系统性质量偏差，ApplyBQSR 输出校正后的 BAM。可比较校准前后的质量分数图，确认经验质量与报告质量更接近。
- 5
逐样本检测
HaplotypeCaller 以 -ERC GVCF 模式运行，WES 用 -L 限定捕获区间并适当外扩。GVCF 同时记录变异位点和非变异区块的置信度，后续新增样本时不必重跑旧样本。
- 6
联合分型
用 GenomicsDBImport 或 CombineGVCFs 汇总多样本 GVCF，再用 GenotypeGVCFs 输出多样本 VCF。联合分型能区分无变异和无覆盖，并借助群体信息提高低覆盖位点的分型准确度。
- 7
变异过滤
样本量足够时用 VQSR 对 SNP 和 Indel 分别建模过滤，样本少时用硬过滤。过滤后检查 Ti/Tv 和每样本变异数是否落在同类数据的常见范围内。
- 8
样本级质控
统计目标区覆盖度，推断性别，计算样本两两亲缘系数和杂合率，与样本信息核对。性别或亲缘关系与记录不符的样本，先排查标签错误或污染，再进入下游分析。
关键参数与决策
VQSR 还是硬过滤
VQSR 需要大量变异来训练高斯混合模型。GATK 文档建议外显子数据样本较少（经验上约 30 个以下）时改用硬过滤，或与公共数据一起联合分型后再建模。单样本和小家系一般直接硬过滤。
硬过滤阈值
GATK 给出的 SNP 起点为 QD < 2.0、FS > 60.0、MQ < 40.0、SOR > 3.0，Indel 为 QD < 2.0、FS > 200.0；应结合各注释值的分布图再调整。
WES 区间外扩
用 -L 指定捕获区间时，常加 -ip 100 左右的外扩，覆盖外显子两侧的剪接区域。不外扩会漏掉紧邻外显子的内含子变异，而这类变异可能影响剪接。
参考基因组版本
新项目建议 GRCh38，注释资源更新更全；需要对接旧数据时才用 hg19。全流程只能用一个版本，已知位点、捕获区间和下游注释库都必须与之对应。
基因型级过滤
下游筛选常用 DP ≥ 10、GQ ≥ 20 作为经验阈值；杂合位点还可检查等位基因比例是否接近 0.5，偏离过大（如只有 10% reads 支持）多为比对伪影或样本污染。
常见错误
- 已知位点文件与参考基因组版本不一致：BQSR 会把真实变异当作测序错误建模，或因染色体名不匹配直接报错，导致质量分数失真。
- 样本很少时强行跑 VQSR：模型训练不收敛或过拟合，过滤结果不稳定，常见表现是大量真实 Indel 被过滤掉。
- 逐样本输出 VCF 再简单合并：合并后无法区分未检出和无覆盖，缺失基因型被当作参考纯合，家系和关联分析都会出错。
- WES 不限定检测区间：捕获区外低覆盖区域产生大量低质量变异，拉低 Ti/Tv，运行时间也成倍增加。
- 不核对性别和亲缘关系：样本标签混淆在家系分析中表现为大量孟德尔错误，容易被误判为新发突变。
结果怎么看
比对与覆盖度报告
包括比对率、重复率、目标区平均深度和达到 20x 的区域比例。常见设计是 WES 目标区平均约 100x、WGS 约 30x；个别样本覆盖明显偏低会导致该样本漏检增多，解读阴性结果时要注明。
变异统计表
每个样本的 SNV 和 Indel 数、杂合与纯合比例、Ti/Tv。WGS 的 Ti/Tv 通常约 2.0 到 2.1，外显子区约 2.8 到 3.0；明显偏低提示假阳性多，某样本变异数远高于同批样本可能有污染。
过滤后的多样本 VCF
FILTER 列标记 PASS 或未通过原因。下游只用 PASS 变异；统计各过滤标签的比例，被淘汰比例异常高说明阈值过严或数据质量有问题。
亲缘与性别核对图
样本两两亲缘系数矩阵和 X 染色体杂合率。亲子和全同胞的亲缘系数应约为 0.5，无关个体接近 0；记录为男性但 X 染色体杂合率高，提示样本错误或污染。
和相近方法怎么选
胚系与体细胞变异检测
胚系变异频率集中在 50% 或 100% 附近，HaplotypeCaller 按二倍体模型分型；体细胞突变频率可能只有百分之几，需要 Mutect2 等工具，并用配对正常样本排除胚系变异。肿瘤研究常两套流程都跑。
GATK 与 DeepVariant
GATK 基于局部组装和统计模型，参数透明、过滤可调；DeepVariant 用深度学习对 reads 堆叠图分类，在公开基准中准确度通常较高，多样本时配合 GLnexus 联合分型。可按计算资源和团队熟悉程度选择。
WES 与 WGS
WES 成本低、编码区深度高，适合大样本和遗传病初筛；WGS 覆盖均匀，能检测非编码变异和结构变异，不受捕获效率影响。WES 阴性的病例常进一步做 WGS。
常见问题
GATK 流程分析一个 WES 样本要多久？
取决于数据量、线程数和存储速度。普通工作站上单个 WES 样本从比对到 GVCF 通常需要数小时，30x WGS 可能需要一天左右。BWA 比对和 HaplotypeCaller 最耗时，可按染色体或区间切分并行。
只有一个样本能用 GATK 吗？
能。单样本按同样步骤生成 GVCF 再分型，过滤用硬过滤而不是 VQSR。单样本缺少群体信息，低覆盖位点的分型可信度较低，候选变异建议在 IGV 中查看 reads，再用 Sanger 测序验证。
BQSR 必须做吗？
GATK 最佳实践包含这一步，用来校正测序仪对碱基质量的系统性高估或低估。高质量数据跳过 BQSR 对最终变异集的影响通常较小。没有已知变异资源的物种，可先做一轮检测，再用高置信变异作为已知位点。
为什么要做 GVCF 联合分型，而不是每个样本单独检测？
联合分型能在所有样本中区分没有变异和没有覆盖，输出完整的基因型矩阵；某个样本覆盖较低时还能借助其他样本的信息提高分型准确度。新增样本时只需为新样本生成 GVCF，再重新联合分型。
参考基因组选 hg19 还是 hg38？
新项目建议 GRCh38，它修正了旧版本的不少序列错误和缺口，主流数据库也已提供对应版本。需要与 hg19 结果对比时可用 liftover 转换坐标，但部分位点无法转换，最好统一从 FASTQ 重新分析。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式中说明 WES 或 WGS、参考版本和样本关系，Codar 会先确认流程，再从 FASTQ 开始完成比对、去重、碱基质量校准和胚系 SNV、Indel 检测，按样本量选择 VQSR 或硬过滤，交付过滤后的 VCF、质控报告和可复现脚本。专业版可远程 SSH 在服务器运行。
我有 12 个罕见病家系成员的 WES 双端 FASTQ 和试剂盒 BED 文件，想按 GATK 流程做到联合分型和过滤后的 VCF。