变异注释与致病性预测：VEP 与 ANNOVAR
变异注释是把 VCF 中的每个变异与已有知识对应起来：它落在哪个基因和转录本、改变了哪个氨基酸、在人群中有多常见、数据库中是否有报道，以及各类算法对其危害性的预测。注释是从数万到数百万个变异中筛出少量候选的前提，也是 ACMG 分类的主要证据来源。最常用的两个工具是 Ensembl 的 VEP 和 ANNOVAR：前者以转录本模型和插件体系为核心，输出可写回 VCF；后者以表格化数据库注释见长。SnpEff 也常用，尤其在非人类物种中。输入是标准 VCF，输出是带注释的 VCF 或表格。
什么时候用
- 罕见病 WES 或 WGS 结果中筛选罕见且可能有害的候选变异
- 肿瘤体细胞突变的功能后果注释，为突变图谱分析做准备
- GWAS 或关联分析显著位点的基因与功能定位
- 为 ACMG 分类收集人群频率、预测分数和 ClinVar 记录
- 评估内含子或同义变异是否可能破坏剪接
不适合的情况
- 把预测分数高直接当作致病结论：计算预测在 ACMG 中只是辅助证据
- 结构变异和大片段 CNV：需要 AnnotSV 等面向区间的注释工具
- 未标准化的 VCF：多等位位点和未左对齐的 Indel 会注释错误或查不到频率
需要准备的数据
- VCF 文件
- 来自胚系或体细胞检测流程，建议只保留 PASS 变异；先拆分多等位位点并左对齐 Indel
- 参考基因组
- 与 VCF 同一版本（GRCh37 或 GRCh38），标准化和生成 HGVS 表达都要用到它
- 注释数据库
- VEP 的离线 cache 与插件数据，或 ANNOVAR 的 refGene、gnomAD、ClinVar 等表
- 表型与家系信息（可选）
- 遗传模式、家系关系和 HPO 表型，用于按遗传模式和表型相关性进一步筛选
分析步骤
- 1
VCF 标准化
用 bcftools norm -m -both 拆分多等位位点，并用 -f 指定参考基因组左对齐 Indel。标准化后同一变异在不同数据库中的表示才一致，否则频率和 ClinVar 匹配会失败。
- 2
确定转录本策略
同一变异在不同转录本上的后果可能不同。报告通常以 MANE Select 转录本为主，VEP 可用 --pick 等选项为每个变异输出一条主要注释，同时保留其他转录本结果备查。
- 3
基因与后果注释
得到基因名、转录本、后果类型（如 missense_variant、stop_gained、splice_donor_variant）以及 HGVS 的 c. 和 p. 表达。抽查几个已知致病变异，确认 HGVS 与文献写法一致。
- 4
人群频率注释
加入 gnomAD 等人群数据库的总体频率和各祖源人群频率。东亚样本应重点看东亚人群频率，有些在总体中罕见的变异在东亚人群中并不少见。
- 5
数据库与预测注释
加入 ClinVar 记录及审核星级，以及 SIFT、PolyPhen-2、CADD、REVEL、AlphaMissense 等错义预测和 SpliceAI 剪接预测。dbNSFP 可一次提供多种错义预测分数。
- 6
分层筛选
按功能后果、人群频率、遗传模式和预测分数逐层过滤，每层记录剩余变异数。隐性病还要找纯合或复合杂合，显性病看杂合与新发。最终候选通常降到几十个以内，再结合表型人工审阅。
- 7
人工核查
在 IGV 中查看候选变异的 reads 支持、链偏倚和比对质量，排除比对伪影；确认该位置在 gnomAD 中覆盖充分，避免把低覆盖造成的频率为 0 当作罕见。
关键参数与决策
人群频率阈值
常染色体显性罕见病常用等位基因频率 < 0.001 或更低，隐性病可放宽到 < 0.01。应参考各祖源人群中的最高频率，而不只看总体频率，否则某一人群中的常见良性变异会被保留。
错义预测分数
CADD PHRED 为 20 表示位于全部可能替换中最有害的 1%，初筛常用 15 到 20；REVEL 取值 0 到 1，越高越倾向致病。多个工具冲突时看整体一致性，不要只挑支持自己结论的那一个。
SpliceAI 阈值
输出受体、供体位点获得与丢失四类 delta 分数。原作者建议 0.2 偏向高召回、0.5 为推荐值、0.8 偏向高精确度。内含子深处的变异也可能有高分，不能只看剪接位点附近几个碱基。
转录本选择
MANE Select 由 RefSeq 与 Ensembl 共同确定并经人工审核，是报告首选；但致病相关的可能是组织特异的其他转录本，候选基因要查看各转录本在相关组织中的表达。
工具与数据库版本
不同版本的 ClinVar 结论和 gnomAD 频率都会变化。复现分析需要记录 VEP cache 版本、ANNOVAR 数据库日期和插件版本，跨批次比较时统一版本重新注释。
常见错误
- 不做标准化就注释：多等位位点整体匹配不到 gnomAD 记录，常见变异被误认为频率为 0，过滤后留下大量假候选。
- 只看总体人群频率：在东亚人群中常见的良性变异可能在总体中很罕见，按总体频率过滤会保留大量假阳性候选。
- 基因组版本错配：hg19 的 VCF 用 hg38 数据库注释，坐标对不上，表现为大量变异无注释或注释到错误基因。
- 把同义变异和内含子变异全部丢弃：部分同义变异和内含子深处变异会破坏剪接，应先用 SpliceAI 筛查后再过滤。
- 每个变异随意取一个转录本：不同转录本上后果可能从错义变为终止，随意选择会漏掉重要后果或报告错误的 HGVS。
结果怎么看
后果类型分布图
统计错义、同义、移码、剪接、终止等后果的变异数。编码区中错义和同义通常占绝大多数；移码或终止变异比例异常高，往往提示 Indel 假阳性或比对问题。
注释结果表
每行一个变异，列出基因、转录本、HGVS、后果、各人群频率、ClinVar 结论和预测分数。重点看频率与后果是否支持致病，以及 ClinVar 审核星级，单一提交者的结论可信度较低。
过滤漏斗表
记录每一步过滤后剩余的变异数。某一步后变异数骤降为零或几乎不变，通常是字段名写错、阈值方向反了或该数据库未成功加载，应先检查这一步。
剪接预测结果
列出 SpliceAI 四类 delta 分数及预测位置偏移。高分变异要看预测的是哪种剪接改变、离外显子多远，最好用 RT-PCR 或 RNA-seq 等转录层面证据验证。
和相近方法怎么选
VEP 与 ANNOVAR
VEP 由 Ensembl 维护，后果术语遵循 Sequence Ontology，插件丰富，结果可写回 VCF；ANNOVAR 以表格化数据库注释为主，配置简单、输出直观，学术用途需注册获取。两者转录本选择可能不同，报告时注明所用工具。
变异注释与 ACMG 分类
注释自动给变异附上频率、后果、预测分数和数据库记录；ACMG 分类在此基础上结合表型、家系和文献判断证据强度并组合成五级结论，其中功能实验、共分离等证据无法从注释自动得到。注释是分类的前置步骤。
SnpEff 与 VEP
SnpEff 提供大量非人类物种的预建数据库，运行快，适合模式生物和农业物种；人类研究中 VEP 与人群数据库、剪接预测插件的整合更方便。两者的后果术语都基于 Sequence Ontology。
常见问题
ANNOVAR 和 VEP 哪个好用？
没有绝对优劣。需要灵活插件（如 SpliceAI、LOFTEE、dbNSFP）和标准 VCF 输出时选 VEP；想快速得到包含多数据库字段的表格选 ANNOVAR。关键是固定版本、记录参数，同一研究内不要混用两套结果。
CADD 分数多少算有害？
CADD PHRED 是排名尺度：10 表示前 10%，20 表示前 1%，30 表示前 0.1%。初筛常用 15 或 20，但它不区分致病机制，不能单独作为致病证据，要与人群频率、变异后果和其他预测综合判断。
gnomAD 中查不到的变异就一定罕见吗？
不一定。先确认该位置在 gnomAD 中覆盖充分，并且 VCF 已经标准化；低覆盖区域、重复序列和未左对齐的 Indel 都会导致查不到。排除这些原因后，频率为 0 才能作为罕见的依据。
同义突变需要关注吗？
需要筛查剪接影响。同义变异不改变氨基酸，但靠近外显子边界或产生新剪接位点时可能致病。用 SpliceAI 等工具筛出高分同义变异，再结合基因与表型的相关性判断是否保留。
ANNOVAR 结果里大量的点（.）是什么意思？
点表示该数据库中没有这个变异的记录。频率列为点通常代表未被收录，但要先排除版本和标准化问题；预测分数列为点常见于非错义变异，因为多数错义预测工具只对错义替换打分。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式中提供 VCF 并说明研究目标，Codar 会先确认参考基因组版本、转录本策略和要使用的数据库，再完成变异功能注释，包括基因与后果、人群频率和已知数据库记录，并给出错义致害性与剪接效应预测分数，按设定的频率和后果条件逐层筛选。交付注释表、过滤漏斗统计、分析报告和可复现脚本。
这是一个先证者 WES 的 VCF（hg38），疑似常染色体隐性遗传病，帮我注释并筛出东亚人群频率低于 1% 的可能有害变异。