结构变异（SV）与 CNV 检测：短读长与长读长
结构变异（SV）通常指长度在 50 bp 以上的基因组改变，包括缺失、重复、倒位、插入和易位；改变拷贝数的缺失和重复又称拷贝数变异（CNV）。SV 是罕见病、肿瘤和群体进化研究的重要变异类型，但短读长测序检测困难：读长比变异短，断点又常落在重复序列中。检测依赖四类信号：读深度变化、插入片段异常的配对 reads、跨断点的 split reads 和局部组装。长读长测序（PacBio HiFi、ONT）能直接跨越大多数 SV，灵敏度和断点精度明显更高。
什么时候用
- WES 或 Panel 阴性的罕见病病例，进一步查找外显子级缺失和重复
- WGS 数据中系统检测缺失、重复、倒位和易位
- 长读长测序数据检测插入、复杂重排和重复区内的 SV
- 群体或育种研究中构建 SV 图谱并比较群体间差异
- 对芯片或核型发现的 CNV 做精细定位，确定断点
不适合的情况
- 肿瘤体细胞拷贝数和纯度倍性估计：需要配对正常样本的肿瘤拷贝数流程
- 区域很少的小 Panel 数据：读深度法缺少足够的参照区域，假阳性高
- 单细胞转录组推断的 CNV：属于表达层面的推断，方法和解读完全不同
需要准备的数据
- 比对后的 BAM 或 CRAM
- 已排序并建索引，保留 split reads 和 supplementary 比对，不要先滤掉多重比对的 reads
- 参考基因组
- 与比对一致的 FASTA 和索引；长读长数据常用 minimap2 或 pbmm2 比对
- 参考样本集（WES CNV）
- 同一捕获试剂盒、同一批次处理的一组样本，作为读深度比较的基线
- 注释资源
- gnomAD-SV、DGV 等人群 SV 数据库，以及基因和剂量敏感性信息，用于过滤常见 SV 和评估影响
- 区间与黑名单
- WES 捕获区间 BED，以及着丝粒、端粒、高重复区等易出错区域列表，用于限定和过滤
分析步骤
- 1
比对质量检查
查看插入片段长度分布、覆盖均匀度和 GC 偏倚。插入片段分布过宽会削弱异常配对信号；覆盖波动大的样本，读深度 CNV 的假阳性会显著增多，需要先确认数据质量。
- 2
短读长 SV 检测
WGS 常用 Manta、DELLY、LUMPY 或 GRIDSS，综合异常配对和 split reads 检测缺失、倒位、易位等。先看每个样本各类 SV 数量是否与同批样本接近，明显偏多的样本要回查质量。
- 3
读深度 CNV 检测
WGS 可用 CNVnator 等按窗口统计深度；WES 用 ExomeDepth、GATK gCNV 等，与参考样本集比较外显子深度。检查待测样本与参考集的深度相关性，相关性偏低时结果不可靠。
- 4
长读长 SV 检测
HiFi 或 ONT 数据用 Sniffles2、cuteSV、pbsv 检测，可以直接得到插入序列和较精确的断点。多样本时 Sniffles2 可先逐样本生成中间文件，再联合调用和分型。
- 5
多工具合并
用 SURVIVOR 或 Jasmine 按类型和断点距离合并不同工具、不同样本的结果，常要求至少两个工具支持以提高精确度。合并后检查同一事件是否被拆成多条记录。
- 6
过滤与注释
去掉落在黑名单区域、支持 reads 过少的 SV，用 AnnotSV 等注释受影响基因、人群频率和剂量敏感性。再按研究目的筛出与表型相关基因重叠的罕见 SV。
- 7
可视化核查与验证
用 IGV 或 samplot 查看候选区域的深度下降、异常配对和 split reads 是否相互印证。重要候选用 qPCR、MLPA、断点 PCR 或长读长测序做独立验证。
关键参数与决策
最小 SV 长度
通常以 50 bp 作为 SV 下限，更小的 Indel 交给小变异流程。读深度法的实际分辨率取决于窗口大小和覆盖深度，在短读长 WGS 中一般要到千碱基量级才可靠。
最少支持 reads
短读长工具要求异常配对和 split reads 达到一定数量；Sniffles2 等长读长工具可按覆盖度自动确定。阈值过低引入大量噪声，过高会漏掉低覆盖区域和嵌合 SV。
合并断点容差
多工具合并时常用几百到 1000 bp 的断点距离，并要求类型一致。短读长断点不精确，容差太小会把同一事件拆开；太大又会把相邻的不同事件合并在一起。
WES CNV 参考样本
参考样本越多、与待测样本处理条件越一致越好。不同批次或不同试剂盒混用会产生系统性深度差异，被误判为外显子缺失或重复。
人群频率过滤
罕见病研究常过滤 gnomAD-SV 等数据库中频率较高的 SV。判断是否为同一事件时按相互重叠比例（常用 50% 以上），而不是只要有重叠就过滤，否则会误删大片段罕见缺失。
常见错误
- 只用单一短读长工具：不同工具对不同 SV 类型的敏感度差异大，单工具结果假阳性和假阴性都偏高，插入和倒位尤其明显。
- WES CNV 不做批次匹配：参考样本与待测样本来自不同捕获批次，GC 和捕获效率差异会在大量外显子上产生假 CNV。
- 不过滤重复区和片段重复区：断点落在低复杂度区或片段重复区的 SV 假阳性比例高，不加黑名单时会充斥结果。
- 把短读长报告的断点当作精确位置：异常配对推断的断点误差可达上百 bp，设计验证引物前应先用 split reads 或长读长确认。
- 用小变异的质控指标评估 SV：SV 质量要看类型分布、长度分布和与人群数据库的重叠率，Ti/Tv 等指标对 SV 没有意义。
结果怎么看
SV 类型与长度分布图
人类基因组中缺失和插入通常占多数，长度分布在约 300 bp 处会出现由 Alu 元件形成的峰。缺少这个峰，或倒位、易位数量异常多，往往提示假阳性较多。
合并后的 SV VCF
每条记录包含类型、断点、长度、支持 reads 数、基因型和支持工具。优先采信多工具一致、支持 reads 多且基因型明确的记录；单工具、低支持的记录需人工核查。
外显子 CNV 图
按外显子展示待测样本与参考集的深度比值。杂合缺失比值应接近 0.5，单拷贝重复接近 1.5；连续多个外显子一致偏移更可信，孤立的单外显子异常常是捕获偏差。
注释与候选列表
列出受影响基因、人群频率和致病性分级。重点看完全覆盖剂量敏感基因的缺失、破坏编码区的断点和与表型一致的候选；分级用于科研筛选，不替代临床诊断。
和相近方法怎么选
短读长与长读长 SV 检测
短读长成本低、样本量大，缺失检测较好，但插入、重复区和复杂 SV 的灵敏度有限；长读长能跨越重复区并读出插入序列，断点精确，适合短读长阴性的病例或构建高质量 SV 图谱。
胚系 CNV 与肿瘤拷贝数分析
胚系 CNV 的拷贝数通常是整数（0、1、3 等），按二倍体模型判断；肿瘤样本存在纯度不足、亚克隆和倍性改变，观测拷贝数是非整数，需要 ASCAT、FACETS 等同时估计纯度和倍性的方法。
测序 CNV 与芯片 CNV
SNP 芯片和染色体微阵列适合检测较大的 CNV，分辨率受探针密度限制；WGS 分辨率更高，还能检测倒位和平衡易位这类拷贝数不变、芯片看不到的事件。
常见问题
WES 数据能检测 CNV 吗？
可以检测外显子级的缺失和重复，但依赖合适的参考样本集和均匀的捕获，单外显子事件和 GC 极端区域可靠性低。WES CNV 结果建议用 MLPA、qPCR 等方法验证，并说明 WES 无法检测平衡易位和倒位。
Manta 和 DELLY 怎么选？
两者都结合异常配对和 split reads。Manta 运行快，胚系和肿瘤配对模式都常用；DELLY 支持多样本联合分型和多种 SV 类型。实际研究常同时运行多个工具再合并，比单独选哪一个更能提高可靠性。
长读长测序做 SV 检测需要多少深度？
没有统一门槛，取决于平台和目标 SV 类型。经验上人类样本 HiFi 十几倍到二十几倍覆盖已能检出大多数胚系 SV，杂合 SV 的检出率随深度增加而提高；嵌合或低比例 SV 需要更高深度。
SV 的 VCF 和 SNV 的 VCF 有什么不同？
SV 记录常用符号等位，如 <DEL>、<DUP>、<INV>，在 INFO 中用 SVTYPE、SVLEN、END 描述类型和长度，易位用 BND 记录两个断点。不同工具字段写法不完全一致，合并和注释前需要统一格式。
检测到的结构变异怎么验证？
先在 IGV 或 samplot 中看 reads 证据，再按类型选择实验：缺失和重复可用 qPCR、MLPA 或断点 PCR，倒位和易位可用跨断点 PCR 加测序，复杂重排建议用长读长测序或光学图谱确认。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式中说明测序类型和研究目的，Codar 会先确认工具组合和过滤条件，再对短读长数据做结构变异检测、对 WES 或 WGS 做生殖系 CNV 检测，长读长数据走长读长变异检测流程，并合并多工具结果。交付 SV 与 CNV 结果表、分布图、候选列表、分析报告和可复现脚本。
我有 6 个罕见病样本的 30x WGS BAM，另有先证者的 HiFi 长读长数据，想找罕见的缺失、重复和倒位，并和短读长结果对照。