单细胞 CNV 推断与恶性细胞识别
单细胞 CNV 推断利用转录组数据间接估计每个细胞的染色体拷贝数变化。原理是：某段染色体扩增或缺失时，位于该区域的一大片基因会整体上调或下调。把基因按染色体位置排序，在滑动窗口内平均表达，再与正常参考细胞比较，就能看到成段的偏移。肿瘤细胞通常带有大片段拷贝数改变，而免疫细胞、基质细胞基本为二倍体，因此这一方法常用于从上皮或肿瘤来源细胞中区分恶性与非恶性细胞，并识别亚克隆。常用工具有 inferCNV、CopyKAT 和 Numbat 等。该方法分辨率通常在染色体臂或大片段水平，无法检测小片段或点突变，结果属于科研分析，不替代临床病理诊断或治疗决策。
什么时候用
- 肿瘤单细胞数据中，需要区分恶性上皮细胞与正常上皮细胞
- 已注释出上皮细胞群，想确认哪些簇具有肿瘤特征性拷贝数改变
- 研究肿瘤内异质性，按 CNV 模式划分亚克隆并比较其转录特征
- 将单细胞 CNV 模式与同一病人的 WES 或芯片拷贝数结果相互印证
- 为后续恶性细胞的差异分析、轨迹或细胞通讯分析提供可靠的细胞子集
不适合的情况
- 检测小片段扩增缺失或局灶性高水平扩增，转录组推断分辨率不足
- 拷贝数改变很少的肿瘤类型，正常与恶性细胞的 CNV 信号差异可能不明显
- 单独作为恶性判定依据，最好结合 marker、患者来源分布和已知 CNV 特征
需要准备的数据
- 原始计数矩阵
- inferCNV 使用原始计数；建议先完成质控和细胞类型注释，含肿瘤与正常参考细胞
- 细胞注释表
- 每个细胞的类型或簇标签，需明确哪些作为正常参考，如 T 细胞、髓系或成纤维细胞
- 基因位置文件
- inferCNV 需要基因到染色体及起止位置的对应表，基因组版本与表达矩阵的注释一致
- 样本来源信息
- 每个细胞所属病人，CNV 推断常按病人分别进行，因为不同病人的 CNV 模式不同
分析步骤
- 1
准备注释与参考
完成细胞类型注释后，选择确定为非恶性的细胞作为参考，常用免疫细胞或基质细胞；若有来自癌旁组织的正常上皮更理想。待判定的上皮或可疑细胞作为观察组。
- 2
按位置排序基因
依据基因位置文件把基因按染色体和坐标排序，剔除位置缺失的基因。性染色体常被排除，避免性别差异干扰；参考和观察细胞若来自不同性别，更需注意。
- 3
运行 CNV 推断
inferCNV 先计算相对参考的表达比值，再做滑动窗口平滑与降噪，可选 HMM 预测离散拷贝状态。CopyKAT 无需指定参考，会先自动识别二倍体细胞，再推断非整倍体。判断标准：参考细胞在热图上应基本平坦。
- 4
查看 CNV 热图
热图行为细胞、列为按染色体排列的基因。肿瘤细胞应在若干染色体臂上呈现成片的红色（扩增）或蓝色（缺失）。对照已知的肿瘤类型常见改变，如某些肿瘤常见的特定臂级扩增缺失，可验证结果合理性。
- 5
计算 CNV 评分
常用做法是对每个细胞的 CNV 信号取平方或绝对值后求平均，得到 CNV 评分；也可计算每个细胞与高 CNV 细胞平均模式的相关性。以评分和相关性为两轴作散点图，恶性细胞通常两者都高。
- 6
判定恶性细胞
结合 CNV 评分、相关性、所在簇和来源病人综合判断。恶性细胞常按病人分开聚类，而正常上皮在不同病人间混合。对边界不清的细胞标为不确定，而不是强行归类。
- 7
亚克隆分析
在恶性细胞内按 CNV 模式层次聚类，或用 inferCNV 的子聚类结果划分亚克隆。比较亚克隆之间的特异 CNV 片段和基因表达差异，可结合空间位置或临床信息研究异质性。
关键参数与决策
正常参考细胞选择
参考应为确定的二倍体细胞，且最好在表达谱上与待测细胞不至相差太远。只用免疫细胞做参考时，上皮细胞特有的表达模式可能被误读为 CNV 信号；有正常上皮时加入参考可减少这种偏差。
inferCNV 的 cutoff
用于过滤低表达基因，inferCNV 文档建议 10x 数据用 0.1，Smart-seq2 等全长数据用 1。阈值过低会引入大量噪音基因，过高则剩余基因太少，染色体覆盖不足。
降噪与 HMM
开启 denoise 可抑制接近参考水平的微弱波动，使热图更清晰；HMM 会预测离散拷贝状态，便于定量，但运行时间显著增加。探索阶段可先关闭 HMM，确认结果后再开启。
按病人分析还是合并分析
不同病人的肿瘤 CNV 模式不同，合并分析时热图易混乱，亚克隆划分也会受病人效应主导。常见做法是按病人分别运行，参考细胞可用同一病人的正常细胞，或在样本量不足时合并全部正常细胞。
CopyKAT 的关键设置
CopyKAT 需设置每条染色体最少基因数、滑动窗口大小等参数，并可提供已知正常细胞名单辅助识别二倍体。自动识别失败时，提供正常细胞名单通常能显著提高判定稳定性。
常见错误
- 参考细胞中混入恶性细胞：参考基线被拉偏，真实的扩增缺失被抵消，恶性细胞看起来接近正常。
- 只用免疫细胞作参考判定上皮细胞：组织特异的成片高表达基因可能在热图上表现为假扩增，正常上皮被误判为恶性。
- 把 CNV 热图上的所有颜色变化都当作拷贝数事件：单个基因或少数基因的高表达也会造成局部信号，应关注跨越染色体臂的大片段一致变化。
- 多个病人合并后按聚类直接划分亚克隆：亚克隆结构被病人间差异主导，得到的其实是病人分组而非肿瘤内异质性。
- 未做质控就推断 CNV：低质量细胞和双细胞会产生异常的 CNV 模式，双细胞尤其可能同时带有肿瘤和正常信号。
- 仅依据 CNV 评分阈值一刀切判定恶性：评分分布常连续，阈值附近细胞归类不稳定，需结合相关性、簇和 marker 判断。
结果怎么看
inferCNV 热图
上方为参考细胞，下方为观察细胞，列按染色体排列。参考区应基本平坦；观察区若出现跨越整条染色体臂的红蓝条带，提示拷贝数改变。参考区也出现明显条带，说明参考中混入了异常细胞或参考选择不当。
CNV 评分与相关性散点图
横轴为 CNV 评分，纵轴为与高 CNV 细胞平均模式的相关性。恶性细胞集中在右上方，正常细胞集中在左下方；中间区域细胞较多时说明区分不清，应检查参考或改用结合等位基因信息的方法。
恶性判定 UMAP
在 UMAP 上按恶性、正常、不确定着色。恶性细胞常按病人形成各自的簇，正常上皮在不同病人间混合；若判定为恶性的细胞分布在免疫细胞区域，说明结果有误。
CopyKAT 预测结果
CopyKAT 输出每个细胞的二倍体或非整倍体预测和拷贝数矩阵。将其与 inferCNV 结果交叉比对，两者一致的细胞可信度高；不一致的细胞应结合 marker 与所在簇进一步判断。
亚克隆 CNV 谱
按亚克隆汇总的平均 CNV 谱，展示各亚克隆共享的主干改变与特有改变。共享改变代表早期事件，亚克隆特有改变代表后期分化，可用于推测肿瘤的克隆演化顺序。
和相近方法怎么选
inferCNV 与 CopyKAT
inferCNV 需要手动指定正常参考，参数可控，热图可读性好，是常用的展示工具。CopyKAT 能自动识别二倍体细胞，适合缺乏明确参考时使用，并直接输出恶性预测。两者结果交叉验证可提高可靠性。
表达推断法与结合等位基因的方法
inferCNV、CopyKAT 只用表达信息，易受细胞类型表达程序干扰。Numbat 等方法结合杂合 SNP 的等位基因失衡信息，能识别拷贝数中性杂合性丢失，判定更稳健，但需要比对文件并做单倍型定相，计算更复杂。
单细胞 CNV 推断与 bulk 肿瘤拷贝数分析
bulk WES、WGS 或芯片拷贝数分析分辨率高，可做 GISTIC 等队列级显著性分析，但只能得到细胞混合后的平均信号。单细胞推断分辨率低，却能区分单个细胞的恶性状态和亚克隆。两者可互相验证。
常见问题
inferCNV 的参考细胞怎么选？
选确定为非恶性的细胞，常用 T 细胞、B 细胞、髓系细胞或成纤维细胞，有癌旁正常上皮时一并加入更好。参考细胞数应足够多，并确认参考区在热图上平坦。参考中混入恶性细胞会抵消真实的 CNV 信号。
怎么用 CNV 结果判断哪些是恶性细胞？
综合三点：CNV 评分高，与肿瘤平均 CNV 模式相关性高，以及在 UMAP 上按病人聚集。还可对照该肿瘤类型已知的常见染色体改变。只满足一项或处于边界的细胞，宜标为不确定。
inferCNV 运行很慢怎么办？
主要耗时在 HMM 步骤。探索阶段可关闭 HMM，只看平滑后的热图；也可对参考细胞做下采样、按病人分别运行，或使用多线程选项。确认结果合理后再对最终细胞集开启 HMM。
inferCNV 和 CopyKAT 结果不一致怎么办？
先看不一致的细胞集中在哪里。若集中在某个簇，检查该簇是否为与参考表达差异很大的正常细胞类型；若分散，多为低 CNV 信号的边界细胞。可结合 marker 判断，或引入基于等位基因的方法进一步确认。
单细胞 CNV 推断能代替 WES 拷贝数检测吗？
不能。转录组推断是间接估计，分辨率在大片段水平，受表达程序影响，无法给出精确断点和拷贝数。它适合在单细胞数据中区分恶性细胞和划分亚克隆，需要准确拷贝数时应使用 DNA 测序或芯片。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明肿瘤类型、病人数量和已有细胞注释后，会先确认正常参考细胞的选择和是否按病人分析。随后进行单细胞 CNV 推断：按染色体位置整理基因，相对参考推断每个细胞的拷贝数变化，计算 CNV 评分和相关性，区分恶性与正常细胞并划分亚克隆。交付 CNV 热图、评分散点图、恶性判定 UMAP、亚克隆 CNV 谱、判定表和可复现脚本。
我有 5 例肺腺癌单细胞数据，已注释出上皮细胞，帮我用 inferCNV 以 T 细胞和成纤维细胞为参考，按病人推断 CNV 并区分恶性上皮
