肿瘤拷贝数变异分析（GISTIC、纯度与倍性）
肿瘤拷贝数变异（CNA）指肿瘤基因组中染色体片段的扩增、缺失或杂合性丢失（LOH），范围从局部的几个基因到整条染色体臂。癌基因扩增（如 ERBB2、MYC）和抑癌基因纯合缺失（如 CDKN2A）是重要驱动事件。分析通常从 WES、WGS、靶向 panel 或 SNP 芯片出发，先得到每个样本的拷贝数分段，再结合等位基因信息估计肿瘤纯度和倍性，把相对比值换算为绝对拷贝数，最后在队列层面用 GISTIC2 找出显著反复出现的改变，并结合突变 VAF 评估克隆结构。
什么时候用
- 找出某癌种队列中反复扩增或缺失的区域与驱动基因
- 比较不同亚型或预后组之间的染色体臂水平改变
- 估计样本肿瘤纯度，用于校正表达或突变分析
- 判断样本是否发生全基因组加倍或高度非整倍体
- 结合突变与拷贝数推算克隆与亚克隆结构
- 计算 LOH 等基因组不稳定指标作为分组依据
不适合的情况
- 检测胚系 CNV 或遗传病相关拷贝数，应使用胚系流程
- 只有单细胞转录组时，需要用表达推断 CNV 的专门方法
- 肿瘤纯度很低的样本，常规方法难以可靠识别拷贝数改变
需要准备的数据
- 肿瘤与正常测序数据
- WES、WGS 或 panel 的 BAM；配对正常或同批次正常池作为参照，减少捕获效率带来的系统偏差
- SNP 芯片数据
- 提供 log R ratio 和 B 等位基因频率，适合等位基因特异的拷贝数与纯度估计
- 分段文件
- GISTIC2 需要包含样本、染色体、起止位置、探针数和 log2 比值的分段表，所有样本同一参考版本
- 体细胞突变 VAF
- 用于结合拷贝数计算癌细胞比例和推断克隆结构，需与拷贝数来自同一样本
分析步骤
- 1
计算覆盖比值
按捕获区或固定窗口统计 reads 数，用正常样本或正常池做参照，校正 GC 含量和捕获效率，得到每个区间的 log2 比值。检查噪声水平，噪声过大的样本后续分段不可靠。
- 2
分段与初步判定
用 CBS 等分段算法把相邻且比值相近的区间合并为片段，再初判增益、缺失。CNVkit、GATK 的 ModelSegments 都可完成这一步，分段数异常多往往提示数据噪声。
- 3
估计纯度与倍性
结合杂合 SNP 的等位基因频率，用 FACETS、ASCAT、Sequenza 等工具同时拟合纯度和倍性。查看候选解的拟合图，若存在多个相近解，需结合突变 VAF 或病理纯度判断。
- 4
换算绝对拷贝数
依据纯度和倍性把 log2 比值换算为整数拷贝数和等位基因拷贝数，识别 LOH 和全基因组加倍。核对一些已知改变，如 ERBB2 阳性样本是否显示高水平扩增。
- 5
GISTIC2 队列分析
输入全部样本的分段文件，GISTIC2 根据改变的频率和幅度计算 G-score，并给出显著扩增、缺失峰和臂水平结果。检查显著峰内的基因，确认是否包含已知癌基因或抑癌基因。
- 6
评估异质性
用拷贝数和纯度校正后的 VAF 计算癌细胞比例，再用 PyClone-VI 等聚类工具推断克隆和亚克隆，也可计算 MATH 等简易异质性指标。
- 7
整合与解读
把驱动拷贝数事件与表达、突变和临床信息联合分析，例如检查扩增样本中该基因表达是否同步升高，或比较不同倍性、不同基因组不稳定程度分组的预后差异。
关键参数与决策
参照样本选择
配对正常最好；没有时用同一捕获试剂、同一批次的正常样本池。参照与肿瘤批次不同会产生波浪状伪信号，被误判为大片段改变。
增益与缺失判定阈值
GISTIC2 通过 -ta 和 -td 设定扩增、缺失的 log2 阈值，默认值偏宽松。低纯度队列信号被稀释，阈值可适当降低，但会增加假阳性，需报告所用值。
显著性 q 值
GISTIC2 默认以 q 值 0.25 作为显著阈值，这是较宽松的探索性标准。用于主要结论时可以更严格，并结合峰内基因的生物学证据判断。
纯度倍性候选解
纯度与倍性存在相互抵消的等价解，例如低纯度二倍体与高纯度四倍体可能拟合得同样好。应查看所有候选解，结合病理纯度和突变 VAF 选择。
胚系 CNV 与性染色体
群体中常见的胚系拷贝数多态应在 GISTIC2 中通过 CNV 文件排除；性染色体受性别影响大，多数研究将其排除或单独处理。
常见错误
- 直接用 log2 比值比较不同样本的扩增程度：纯度和倍性不同，同样的比值对应的真实拷贝数可能差别很大。
- 没有正常参照或参照批次不匹配：捕获效率差异会表现为大片段假增益或假缺失，GISTIC2 会把它们当成反复事件。
- 把 GISTIC2 峰内所有基因都当驱动：显著峰常包含多个基因，需结合表达相关性和已知功能判断真正的靶基因。
- 忽视全基因组加倍：倍性约为 4 的样本若按二倍体解读，会把大量只有 3 个拷贝的区域误判为缺失。
- 低纯度样本纳入异质性分析：信号被正常细胞稀释，亚克隆结构推断误差很大，应设置纯度下限后再分析。
- 不同平台的分段数据直接合并跑 GISTIC2：芯片与测序的噪声和分辨率不同，合并前需分别校正或分开分析。
结果怎么看
全基因组拷贝数图
横轴按染色体排列，纵轴为 log2 比值或绝对拷贝数。看片段边界是否清晰、整体噪声大小；若曲线呈周期性波动或与 GC 含量相关，说明校正不足。
GISTIC2 显著区域图
上下两侧分别展示扩增和缺失的 G-score 或 q 值，标注显著峰及代表基因。看峰的高度与宽度，窄而高的峰更可能指向单一驱动基因，宽峰需进一步缩小候选。
基因水平拷贝数表
GISTIC2 的阈值化结果把每个基因在每个样本中记为 -2 到 2，分别代表深缺失、浅缺失、无改变、低水平增益和高水平扩增。分组比较时通常只看 -2 和 2。
纯度倍性拟合图
展示各候选纯度与倍性组合的似然或误差分布，以及最终选用的解。最优解与次优解差距很小时结论不稳；纯度估计与病理估计相差很大时，需核查样本或参照。
克隆结构图
癌细胞比例的分布或聚类结果，接近 1 的簇为克隆性改变，较低的簇为亚克隆。簇内突变太少或簇间界限模糊时，不宜过度解读演化顺序。
和相近方法怎么选
CNVkit、GATK CNV 与 FACETS
CNVkit 适合 WES 和 panel，可用正常池作参照；GATK 体细胞 CNV 流程与其突变检测体系衔接；FACETS 利用杂合 SNP 做等位基因特异分析，可同时估计纯度和倍性。只需增益缺失时前两者即可，需要绝对拷贝数时选后者。
肿瘤体细胞 CNA 与胚系 CNV 检测
胚系 CNV 存在于所有细胞，拷贝数是整数且不受纯度影响；肿瘤 CNA 受纯度、倍性和亚克隆影响，表现为非整数比值。两者的算法假设不同，不能互相替代。
基于 DNA 与基于表达的纯度估计
DNA 方法利用拷贝数和等位基因频率，直接反映肿瘤细胞比例；ESTIMATE 等表达方法根据基质和免疫基因推断，适合只有转录组的情况，但受微环境组成影响较大。
常见问题
GISTIC2 的输入文件格式是什么？
主要输入是分段文件，每行一个片段，包含样本名、染色体、起始和终止位置、探针或区间数以及 log2 比值，列顺序固定。还需要参考基因组注释文件，可选提供胚系 CNV 文件用于排除常见多态。
GISTIC2 结果里的 q 值和 G-score 怎么看？
G-score 综合了该区域改变的频率和幅度，越高说明越常出现且幅度越大；q 值是校正后的显著性。通常关注 q 值低于阈值的峰，再看峰内是否有已知癌基因或抑癌基因。
肿瘤纯度用什么方法估计？
有测序数据时，常用 FACETS、ASCAT、ABSOLUTE 等基于拷贝数和等位基因频率的方法；只有转录组时可用 ESTIMATE 等表达方法；也可参考病理切片估计。不同方法结果常有差异，可取多种方法比较。
全基因组加倍怎么判断？
一般看倍性估计值和主要等位基因拷贝数。若基因组大部分区域的主要等位基因拷贝数达到 2 及以上，倍性明显高于二倍体，常判为发生过全基因组加倍。具体标准随工具而异。
WES 能做拷贝数分析吗？
可以。WES 只覆盖外显子，分辨率和断点精度不如 WGS，但对臂水平和较大片段改变足够，配合正常参照和杂合 SNP 也能估计纯度和倍性。对小片段和非编码区改变检测能力有限。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供比对文件、芯片数据或已有分段结果，并说明癌种和分组。Codar 确认方案后完成拷贝数分段和驱动事件识别，找出队列中显著扩增、缺失的区域和基因，估计肿瘤纯度与倍性，并评估瘤内异质性和克隆结构。交付拷贝数图、显著区域图、基因水平拷贝数表、纯度表、报告和可复现脚本。
我有 80 例食管鳞癌 WES 的肿瘤和正常 BAM，帮我做拷贝数分段和 GISTIC2 分析，估计纯度倍性，比较复发与未复发组