突变特征、TMB 与 MSI 分析
这三项分析都以体细胞突变为原料，但回答不同问题。突变特征分析把每个样本的 SNV 按突变类型和前后碱基分为 96 类，用矩阵分解或拟合找出背后的突变过程，如老化、吸烟、紫外线、APOBEC 或同源重组缺陷。TMB 是每兆碱基编码区中的体细胞突变数，常用于免疫治疗相关研究。MSI 反映错配修复缺陷导致的微卫星长度改变，可由测序数据计算。三者相互印证：MMR 缺陷样本通常同时表现为 MSI-H、高 TMB 和相应的突变特征。
什么时候用
- 推断肿瘤突变背后的病因或修复缺陷类型
- 比较不同暴露因素或亚型之间的突变过程差异
- 计算 TMB 并与免疫治疗应答或免疫浸润做关联
- 统一不同 panel 与 WES 的 TMB 口径后合并分析
- 从 WES 或 panel 数据判断样本 MSI 状态
- 寻找同源重组缺陷相关特征，作为其他指标的佐证
不适合的情况
- 单个样本突变很少时做 de novo 提取，结果不稳定
- 把测序得到的 MSI 或 TMB 直接当作用药依据
- 未过滤 FFPE 伪影的数据做签名分析
需要准备的数据
- 体细胞突变 MAF 或 VCF
- 经过胚系与伪影过滤的配对检测结果；需注明参考基因组版本，以便提取三核苷酸背景
- 有效覆盖区域
- WES 或 panel 的捕获区 BED 及实际达到深度要求的区域大小，作为 TMB 的分母
- 肿瘤与正常 BAM
- MSI 打分需要读取微卫星位点的长度分布；配对模式比 tumor-only 更可靠
- 参考签名集
- 通常使用 COSMIC 发布的 SBS、DBS、ID 签名；记录所用版本，不同版本编号与内容有差异
- 已知 MSI 状态样本
- 经 PCR 或 IHC 确定状态的样本，用于在本平台上校准 MSI 分数阈值
分析步骤
- 1
构建突变谱矩阵
按参考基因组提取每个 SNV 前后各一个碱基，得到样本乘 96 类的计数矩阵。画出每个样本的 96 通道柱状图，先肉眼检查是否有异常集中的通道。
- 2
提取或拟合签名
样本数多时可用 NMF 做 de novo 提取，根据稳定性和重构误差选签名数，再与 COSMIC 比对命名；样本少时直接用已知签名做拟合，只估计每个签名的贡献。
- 3
评估拟合质量
计算原始突变谱与重构谱的余弦相似度。相似度偏低说明签名集不完整或突变数太少；对贡献很小的签名做 bootstrap 检验，避免过度解读。
- 4
确定 TMB 口径
明确分子计哪些突变（仅非同义或全部编码区突变）、是否去除已知热点和胚系残留，分母使用实际有效覆盖区域大小，口径在全队列保持一致。
- 5
计算与换算 TMB
按样本计算每 Mb 突变数。合并不同平台数据时，用同时有 panel 和 WES 结果的样本拟合换算关系，或参考公开的协调研究，把各平台转换到同一尺度。
- 6
计算 MSI 分数
用 MSIsensor 系列等工具统计微卫星位点中长度分布不稳定的比例。对照所用工具和平台的阈值判定 MSI-H、MSS，并与 MMR 基因突变和突变特征交叉核对。
关键参数与决策
签名数 k 的选择
de novo 提取时，在多个 k 下比较解的稳定性与重构误差，选在两者之间取得平衡的 k。k 过大会把同一过程拆成多个噪声签名，过小则合并不同过程。
拟合使用的签名子集
全部 COSMIC 签名拟合容易出现大量小贡献的假阳性签名。常见做法是先限定为该癌种已报道的签名，再加入数据中明显存在的特征。
TMB 分子范围
WES 研究常只计非同义突变，panel 往往计入同义突变以增加计数。两种口径数值不同，比较前必须统一，并在方法中写清楚。
TMB 高低分组阈值
部分研究使用 10 mut/Mb，这一数值与特定 panel 和适应证相关，不宜照搬到其他平台。科研分组也可在队列内按分位数划分。
MSI 判定阈值
MSI 分数阈值随工具、版本和 panel 不同而变化，应使用该工具在相同平台上的推荐值或用已知 MSI 状态样本校准，接近阈值的样本标为不确定。
参考基因组与区域归一化
三核苷酸背景从参考序列中提取，hg19 与 hg38 坐标不能混用。外显子区域的三核苷酸组成与全基因组不同，用 WES 数据拟合全基因组签名时，需选用对应版本的签名或先做归一化。
常见错误
- 突变数很少的样本单独拟合签名：几十个突变就能拟合出多个签名，贡献估计误差极大，应合并样本或只报告主要签名。
- FFPE 伪影未过滤：甲醛损伤带来的 C>T 会被拟合进以 C>T 为主的签名，抬高其贡献，造成错误的病因推断。
- TMB 分母写成整个外显子组理论大小：实际有效覆盖区域通常更小，分母偏大会系统性低估 TMB。
- tumor-only 数据直接算 TMB：残留胚系变异会抬高 TMB，在非欧洲人群中偏差往往更明显。
- 把不同 panel 的 TMB 直接混合比较：各 panel 基因组成和检测流程不同，未经换算的数值不在同一尺度上。
- 只看 MSI 分数不看 MMR 状态：低纯度样本可能被判为 MSS，应结合 MMR 基因改变和突变特征综合判断。
结果怎么看
96 通道突变谱图
横轴是六类碱基替换各分 16 种前后碱基背景。TCW 背景中 C>T 和 C>G 富集提示 APOBEC，C>A 突出常与吸烟相关，CC>TT 和 C>T 高度集中提示紫外线。
签名贡献堆叠图
每列是一个样本，颜色表示各签名贡献的突变数或比例。关注主导签名在不同亚型中的分布；某签名在所有样本都只贡献很小比例，多半是拟合噪声。
TMB 分布图
按样本或分组展示每 Mb 突变数，常取对数坐标。极高 TMB 的离群样本应核对是否为 MMR 缺陷或 POLE 突变；整体偏高时先排查胚系残留。
MSI 分数与状态表
列出每个样本的 MSI 分数、判定状态和 MMR 相关改变。分数接近阈值、纯度低或覆盖不足的样本应标注为不确定，不宜直接归入 MSI-H 或 MSS。
和相近方法怎么选
de novo 提取与已知签名拟合
de novo 提取能发现新的或队列特有的突变过程，但需要足够多的样本和突变；拟合只估计已知签名贡献，适合小样本和单样本。实践中常先提取，再用拟合确认。
测序 MSI 与 PCR、IHC 检测
PCR 检测单核苷酸重复位点的长度变化，IHC 看 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 蛋白是否缺失，是临床常用方法；测序法可与突变检测同时完成，但阈值依赖平台。科研中可互为佐证。
TMB 与新抗原负荷
TMB 只统计突变数量，新抗原负荷进一步预测哪些突变肽能被患者 HLA 呈递。后者更接近免疫原性，但依赖 HLA 分型和预测算法，误差来源更多。
SigProfiler、MutationalPatterns 与 deconstructSigs
SigProfiler 系列面向大规模提取与拟合，命名与 COSMIC 体系一致；MutationalPatterns 是 R 包，提取、拟合和绘图集成度高；deconstructSigs 只做单样本拟合，适合突变数较多的样本。
常见问题
TMB 怎么计算？
TMB 等于符合条件的体细胞突变数除以有效覆盖区域的 Mb 数。关键在于两点：分子统计哪些类型的突变，分母用实际达到测序深度要求的区域。不同研究口径不同，报告时要写明这两项。
多少个突变才能做突变特征分析？
没有统一硬门槛。突变越少，各签名贡献的估计误差越大。WES 中突变较少的样本通常只报告主导签名，或把同组样本合并后分析；de novo 提取还需要较多样本才能稳定。
COSMIC SBS 签名分别代表什么？
部分已知病因较明确：SBS1 和 SBS5 与年龄相关，SBS2 和 SBS13 与 APOBEC 活性有关，SBS3 与同源重组缺陷相关，SBS4 与吸烟相关，SBS7 系列与紫外线相关，还有多个签名与 MMR 缺陷相关。仍有不少签名病因未明。
panel 的 TMB 和 WES 的 TMB 能比较吗？
不能直接比较。panel 区域小、基因选择偏向癌症基因，统计口径也常不同。需要用同时有两种数据的样本建立换算关系，或参考公开的 TMB 协调研究，换算后再比较。
MSI-H 一定 TMB 高吗？
多数 MSI-H 肿瘤 TMB 较高，但反过来不成立。高 TMB 也可来自 POLE 突变、吸烟或紫外线暴露，这类样本可能是 MSS。区分时结合 MSI 分数与突变特征最直接。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供体细胞突变结果和测序文件并说明平台。Codar 确认方案后构建 96 通道突变谱，提取或拟合 COSMIC 签名；按统一口径计算 TMB 并做平台间换算；计算 MSI 分数并给出解释。交付突变谱图、签名贡献图、TMB 与 MSI 汇总表、报告和可复现脚本。结果仅供科研。
我有 60 例胃癌 WES 的 MAF 和 BAM，帮我做 COSMIC 突变特征拟合，计算 TMB 和 MSI，并比较 EBV 阳性与阴性组