新抗原预测与 HLA 分型
新抗原是由肿瘤体细胞突变产生、正常组织中不存在、并可能被 HLA 分子呈递给 T 细胞的突变肽段。新抗原预测把肿瘤与配对正常样本的测序数据转化为候选肽列表：先确定患者的 HLA 分型，再从错义突变、移码突变和融合基因中生成跨越突变位点的短肽，用 NetMHCpan 等模型预测肽与 HLA 的结合和呈递，最后结合表达量、等位基因频率和克隆性排序。典型输入是肿瘤-正常配对的 WES 或 WGS 加肿瘤 RNA-seq。结果常用于肿瘤疫苗和 T 细胞治疗的靶点筛选研究，以及新抗原负荷与免疫浸润、疗效的关联分析。本页介绍的是科研分析方法，不替代临床诊断或治疗决策。
什么时候用
- 从肿瘤-正常配对 WES/WGS 数据中筛选个体化新抗原候选肽
- 计算新抗原负荷，分析其与免疫浸润、生存或疗效的关联
- 评估 KRAS G12D 等热点突变能被哪些 HLA 等位基因呈递
- 研究 HLA 杂合性缺失等抗原呈递缺陷与免疫逃逸的关系
- 为移植、感染或 NK 细胞研究提供 HLA 与 KIR 基因型
不适合的情况
- 只有肿瘤、没有正常对照：胚系变异难以去除，会产生大量假新抗原
- 把预测结合强直接等同于有免疫原性，候选肽仍需实验验证
- 低深度、小基因 panel 数据：突变太少，负荷估计和排序都不可靠
需要准备的数据
- 体细胞突变 VCF
- 肿瘤-正常配对检出并过滤的体细胞突变，需注释出转录本和蛋白改变，才能生成突变肽段。
- 肿瘤 RNA-seq
- 用于判断突变基因是否表达、突变等位基因在转录本中的比例；未表达的突变通常排除。
- HLA 分型结果
- 至少两位字段分辨率（如 HLA-A*02:01）的 I 类等位基因；研究 CD4+ T 细胞反应还需 II 类。
- 融合与移码信息（可选）
- 融合断点和移码产生的新读码框会带来全新序列，需有 RNA 读段支持其表达。
分析步骤
- 1
HLA 分型
用正常样本的 WES/WGS 或 RNA-seq 数据分型，I 类常用 OptiType，也可用 HLA-HD、arcasHLA 等交叉核对。再比较肿瘤样本中两个等位基因的读段，判断是否存在 HLA 杂合性缺失。
- 2
突变整理注释
保留通过过滤的体细胞 SNV 和 indel，注释到转录本和蛋白位置。确认参考基因组版本与注释数据库一致，否则生成的肽段会整体错位，后续预测全部失真。
- 3
生成候选肽段
以突变位点为中心，用滑窗生成 8 到 11 个氨基酸的 I 类候选肽，II 类常用 15 肽。同时生成对应的野生型肽段，用于后续比较突变对结合的影响。
- 4
结合与呈递预测
用 NetMHCpan 预测 I 类结合，NetMHCIIpan 预测 II 类结合，可用 MHCflurry 交叉验证。以洗脱配体（EL）百分位排名为主要依据，结合亲和力 IC50 作为参考。
- 5
整合表达与克隆性
合并基因表达量、DNA 中突变等位基因频率、RNA 中突变读段数和克隆性估计。只存在于小亚克隆的突变覆盖的肿瘤细胞有限，排序时应降权。
- 6
候选排序过滤
综合结合排名、突变肽与野生型肽的结合差异、表达量和稳定性打分排序，剔除与正常人蛋白序列完全相同的肽段。pVACtools 可串联上述步骤并输出排序表。
- 7
验证规划
对排名靠前的候选规划 ELISpot、四聚体染色或免疫肽组质谱验证。报告中明确区分「预测可结合」和「实验证实有免疫原性」两类结果。
关键参数与决策
结合排名阈值
NetMHCpan 对 I 类默认把百分位排名小于 0.5% 视为强结合、小于 2% 视为弱结合。排名可在不同等位基因间比较，比统一的 IC50 阈值更合理，建议作为主要筛选标准。
肽段长度
I 类分子以 9 肽最常见，但 8、10、11 肽也有相当比例，通常全部计算；II 类结合槽两端开放，常用 15 肽滑窗。只算 9 肽会遗漏一部分候选。
表达量过滤
常要求突变基因有一定表达（如 TPM 大于 1，属经验值），并在 RNA 中检出突变读段。阈值过严会漏掉低表达但免疫原性强的候选，可以分层报告而不是一刀切。
突变与野生型结合差异
若野生型肽本身也强结合，相应 T 细胞可能已被中枢耐受清除。常计算二者结合排名或亲和力的比值，优先保留野生型结合弱、突变型结合强的候选。
HLA 分型分辨率
结合预测至少需要两位字段分辨率。只有一位字段（如 HLA-A*02）时，同组内不同亚型的结合特性差异很大，预测结果不能使用。
常见错误
- 只用肿瘤样本做 HLA 分型：肿瘤中可能存在 HLA 杂合性缺失，丢失的等位基因会被漏检或误判为纯合。
- 统一用 IC50 小于 500 nM 筛选：不同等位基因的亲和力分布差异很大，会使某些等位基因候选过多、另一些几乎没有。
- 参考基因组与注释版本不一致：坐标与转录本错配会生成错误肽段，结合预测和排序结果全部失真。
- 不检查突变是否表达：未表达基因上的突变不会产生肽段，混入后会明显高估新抗原负荷。
- 把新抗原负荷和 TMB 同时放进模型：二者通常高度相关，会产生共线性，系数和显著性都难以解释。
结果怎么看
候选新抗原排序表
每行一个突变肽与 HLA 的组合，列出肽段、等位基因、EL 排名、IC50、野生型对照、表达量和 VAF。靠前的候选应同时满足强结合、有表达和克隆性；高分候选集中在单个等位基因时，先复核分型。
HLA 分型报告
列出 HLA-A、B、C 及 II 类各位点的两个等位基因和多个工具的一致性。正常样本为杂合，而肿瘤中某个等位基因的读段明显减少，提示 HLA 杂合性缺失。
新抗原负荷分布图
比较各样本或分组的预测新抗原数量。负荷与 TMB 通常呈强正相关；若某样本 TMB 很高但新抗原极少，需检查表达过滤、HLA 分型或杂合性缺失是否导致异常。
突变与野生型排名散点图
横轴为野生型肽排名，纵轴为突变肽排名。落在野生型弱结合、突变型强结合区域的点是优先候选；大量点贴近对角线，说明多数突变对结合影响不大。
和相近方法怎么选
NetMHCpan 与 MHCflurry
两者都用亲和力数据和质谱洗脱配体数据训练。NetMHCpan 覆盖等位基因广、使用最普遍；MHCflurry 是开源 Python 工具，便于批量集成。实际中常以一个为主、另一个交叉验证，两者都靠前的候选更可信。
I 类与 II 类新抗原预测
I 类预测面向 CD8+ T 细胞，模型较成熟；II 类结合槽两端开放、核心序列位置不固定，预测准确性普遍低于 I 类。研究 CD4+ T 细胞反应时仍应纳入 II 类，但对其排名应更保守。
新抗原预测与 TMB 分析
TMB 只统计突变数量，新抗原预测进一步考虑 HLA 呈递和表达，更接近免疫识别过程，但依赖分型和预测模型，误差来源更多。大队列关联分析 TMB 更稳健，个体化候选筛选需要新抗原预测。
常见问题
HLA 分型可以用 WES 数据做吗？
可以。OptiType 等工具能从 WES 或 RNA-seq 数据完成 I 类 HLA 两位字段分型，一般优先用正常样本的数据。II 类位点多态性更复杂，从 WES 推断的准确度通常低于 I 类，关键样本可用专门的 HLA 测序复核。
NetMHCpan 的 EL 和 BA 有什么区别？
BA 预测肽与 HLA 的结合亲和力，输出 IC50 和对应排名；EL 预测肽被细胞加工并呈递到细胞表面的可能性，训练数据来自质谱鉴定的洗脱配体。筛选新抗原时通常以 EL 百分位排名为主，BA 作为补充。
预测出来的新抗原一定有免疫原性吗？
不一定。结合与呈递只是 T 细胞识别的前提，真正引起 T 细胞反应的候选只占一小部分，还受 T 细胞库、肽段与自身蛋白相似度等因素影响。需要 ELISpot、四聚体染色等实验验证，论文中应区分预测和验证结果。
移码突变和融合基因要不要纳入？
建议纳入。移码和融合会产生一段与自身蛋白差异很大的新序列，通常被认为更可能具有免疫原性。但需要 RNA 证据确认转录本确实表达，移码肽段要从突变位点一直生成到新的终止密码子。
KIR 分型有什么用？
KIR 是 NK 细胞表面识别 HLA I 类分子的受体家族，KIR 基因型与对应 HLA 配体的组合会影响 NK 细胞的活化与抑制。在造血干细胞移植、病毒感染和肿瘤免疫研究中，常把 KIR 与 HLA 分型一起分析。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供配对突变数据或测序文件和研究目标后，会先确认 HLA 分型的数据来源、肽段长度和筛选阈值，再进行 HLA 与 KIR 分型；随后进行肿瘤抗原与表位预测，生成突变肽段，并完成肽-MHC 结合与呈递预测，结合表达和等位基因频率对候选排序。交付候选新抗原排序表、HLA 分型结果、负荷分布图、分析报告和可复现脚本。
我有 8 例结直肠癌肿瘤-正常配对 WES 的体细胞 VCF 和肿瘤 RNA-seq，想做 HLA 分型并预测 I 类新抗原，按结合排名和表达量排序。