RNA-seq 融合基因检测
融合基因是两个独立基因因易位、倒位、缺失等结构变异连在一起，转录出跨两个基因的嵌合转录本。部分融合是肿瘤驱动事件和分型依据，如 BCR-ABL1、EML4-ALK。RNA-seq 检测依靠两类证据：跨越连接点的分裂读段（junction reads），以及两端分别比对到两个基因的双端片段（spanning fragments）。STAR-Fusion 和 Arriba 都基于 STAR 嵌合比对，典型数据是肿瘤组织或细胞系的双端 RNA-seq。本页属科研分析方法，不能替代临床检测和诊疗决策。
什么时候用
- 在肿瘤组织或细胞系转录组中筛查已知和新的融合转录本
- 肉瘤、白血病等融合驱动型肿瘤的分子特征研究
- 在公共肿瘤队列中统计某个融合的发生频率
- DNA 测序提示结构变异，需要确认是否表达为融合转录本
- 构建融合阳性细胞模型后，确认融合转录本表达及连接位置
不适合的情况
- 不表达或表达极低的重排：RNA 检测不到，需做 DNA 层面结构变异检测
- 3′ 端测序或很短的单端读段：跨连接点读段很少，灵敏度很低
- 用严重降解的 RNA 得到阴性结果后排除融合：假阴性风险高
需要准备的数据
- FASTQ 文件
- 推荐双端测序，读长越长跨连接点读段越多；工具通常从 FASTQ 重新比对，不必预先提供 BAM
- CTAT 基因组资源库
- STAR-Fusion 依赖配套 CTAT genome lib（含索引、注释和过滤资源），须与基因组版本一致
- Arriba 过滤资源
- Arriba 提供与基因组版本对应的黑名单和已知融合列表，用于去除正常样本中常见的假阳性
- 样本信息
- 肿瘤类型、原发组织或细胞系、RNA 质量指标（如 RIN、DV200），用于判断灵敏度和排序优先级
分析步骤
- 1
嵌合比对
用 STAR 开启嵌合比对输出。STAR-Fusion 可直接从 FASTQ 运行并内部调用 STAR；Arriba 推荐 STAR 以 --chimOutType WithinBAM 输出嵌合读段，并采用其文档给出的参数。
- 2
运行检测工具
两个工具独立运行。STAR-Fusion 输出 fusion_predictions.abridged.tsv；Arriba 输出 fusions.tsv 和被过滤的 fusions.discarded.tsv。记录工具与参考资源版本。
- 3
读取证据数
STAR-Fusion 看 JunctionReadCount 和 SpanningFragCount 两列，Arriba 看分裂读段数、不一致配对数和可信度分级。没有跨连接点读段的候选可信度低。
- 4
过滤假阳性
去除相邻基因间的通读转录本、高度同源基因之间的伪融合，以及线粒体、核糖体和组蛋白基因相关候选；在多个无关样本或正常样本中反复出现的低支持融合也应降权。
- 5
注释功能影响
查看连接点是否落在外显子边界、融合是否保持阅读框，以及保留了哪些蛋白结构域，例如 3′ 伙伴的激酶结构域是否完整、5′ 伙伴是否提供强启动子或二聚化结构域。
- 6
对照已知融合
将候选与 COSMIC、Mitelman 等融合数据库及文献比对，区分已报道的驱动融合与新融合。新融合需要更多证据，如多个独立读段起点、两个工具同时检出。
- 7
可视化与验证
用 Arriba 的 draw_fusions.R 或 FusionInspector 生成连接点示意和读段比对，再设计跨连接点引物做 RT-PCR，并用 Sanger 测序确认连接序列与预测一致。
关键参数与决策
支持读段阈值
通常要求至少有跨连接点读段，且总支持数达到数条（经验值）。阈值越严假阳性越少，但会漏掉低表达的真实融合，应结合 FFPM 和是否已知综合判断。
多工具结果合并
常见做法是把 STAR-Fusion 与 Arriba 都检出的候选作为高可信集合，单一工具检出的新融合列为待验证。已知驱动融合即使只被一个工具检出，也值得优先验证。
剪接类型
STAR-Fusion 的 SpliceType 为 ONLY_REF_SPLICE 表示连接点落在注释剪接位点上，更像真实融合转录本；INCL_NON_REF_SPLICE 的候选需要更多证据。
阅读框
in-frame 融合更可能产生功能性融合蛋白；out-of-frame 融合也可能通过破坏抑癌基因起作用，不应一律丢弃，但在筛选新融合时优先级通常较低。
参考资源版本
CTAT 资源库和 Arriba 黑名单都与特定基因组版本绑定，GRCh37 与 GRCh38 资源混用会导致注释错位或过滤失效，运行前统一核对。
常见错误
- 把通读转录本当融合：相邻同向基因之间的转录通读在正常组织中普遍存在，不加过滤会占据候选列表的很大比例。
- 只看总读段数不看证据结构：支持全部来自跨越片段而没有跨连接点读段时，无法确定精确连接位置，也可能是比对错误。
- 忽略样本间交叉污染：同一个低支持融合出现在多个无关样本中，可能来自文库交叉污染，而不是复发性融合。
- 把细胞系融合当作原发肿瘤特征：长期传代的细胞系会积累新的重排，需要在原发样本或队列数据中确认其代表性。
- 跨连接点读段全部起点相同仍当作多条证据：这通常是 PCR 重复，实际只相当于一个分子，应看独立起点的数量。
- 只用一种工具且不做复核：不同算法的假阳性来源不同，单一工具的新融合未经读段复核和实验验证，结论风险较高。
结果怎么看
融合候选表
每行一个候选，列出 5′ 和 3′ 伙伴基因、连接点坐标、两类证据读段数和表达量。先看已知驱动融合，再看高支持的新融合；同一基因对有多个连接点，通常反映不同的剪接形式。
融合结构示意图
展示两个基因的外显子结构、连接位置和保留的蛋白结构域。重点看 3′ 伙伴的功能域是否完整，融合蛋白是否保持阅读框，以及 5′ 伙伴提供的启动子。
连接点读段比对
在 FusionInspector 或 IGV 中查看读段是否以不同起点跨越连接点，两侧序列是否高质量比对且无大量错配。读段集中在同一起点或两侧序列高度相似时需警惕伪迹。
队列频率统计
多样本研究中按融合汇总阳性样本数和比例。某融合在几乎所有样本中都出现，包括正常样本，更可能是通读或技术伪迹，而不是肿瘤特异事件。
和相近方法怎么选
STAR-Fusion 与 Arriba
两者都依赖 STAR 的嵌合比对。STAR-Fusion 配合 CTAT 资源和 FusionInspector，便于逐个复核证据；Arriba 运行快、过滤规则细，输出可信度分级并附绘图脚本。两者联合使用是常见做法。
RNA 融合检测与 DNA 结构变异检测
RNA-seq 只能发现被表达的融合，但能直接给出外显子连接方式和阅读框；全基因组测序能发现所有基因组断点，包括内含子内断点和不表达的重排，却不能确认转录结果。两者互补，详见结构变异检测页。
全转录组与靶向融合 Panel
全转录组可以发现新伙伴基因，但对低表达融合灵敏度有限；靶向 RNA Panel 对预设基因灵敏度高，适合 FFPE 样本，却发现不了 Panel 以外的伙伴。
常见问题
融合基因需要多少条读段支持才可信？
没有统一标准。经验上至少应有跨连接点读段，并有数条来自不同起点的支持；已知驱动融合可接受较低支持数，新融合要求更高，并需要 RT-PCR 加 Sanger 测序确认连接序列。
为什么同一个融合会报告多个连接点？
同一次 DNA 重排转录后，可经可变剪接产生多种外显子连接方式；不同样本的 DNA 断点也可能不同。应按外显子连接方式分别列出，并分别判断阅读框和保留的结构域。
单端测序数据能检测融合吗？
可以，但只能依靠跨连接点读段，缺少跨越片段这一类证据，灵敏度会下降，假阳性也更难排除，读长较短时问题更明显。条件允许时优先使用双端测序数据。
没有正常对照样本怎么过滤假阳性？
使用 Arriba 自带的黑名单和 CTAT 资源中的正常组织融合列表过滤，再排除通读和同源基因对。还可以对照公开的正常组织 RNA-seq 检测结果，剔除在正常组织中也常见的候选。
在 Codar 里怎么做
Codar 先确认样本类型、参考基因组版本和检测工具组合，再运行融合转录本检测，汇总每个候选的伙伴基因、连接点和两类读段证据，并标注通读、同源基因等常见假阳性。交付融合候选表、证据统计和可复现脚本。人类样本比对内存需求较高，专业版可通过远程 SSH 在服务器上运行。
我有 8 例肉瘤组织的双端 RNA-seq FASTQ，请用 STAR-Fusion 和 Arriba 检测融合基因，列出两种工具都检出的高可信融合