靶向测序 Panel 分析与覆盖度评估
靶向测序只测预先设计的一组基因或区域，常见的是几十到几百个基因的肿瘤或遗传病 Panel，也包括全外显子（WES）这类大范围捕获。由于测序资源集中在靶区，能以较低成本获得几百到上千倍的深度，适合检测低比例体细胞突变或大批样本筛查。建库方式分为杂交捕获和多重 PCR 扩增子两类，它们的去重方式、引物处理和覆盖特征都不同。靶向数据分析的核心除了变异检测，更重要的是评估捕获是否成功：多少读段落在靶区、靶区深度是否均匀、哪些区域覆盖不足无法下结论。这些指标决定了阴性结果能否被信任。本页内容属于科研分析，不替代临床检测报告。
什么时候用
- 肿瘤热点基因 Panel，需要高深度检测低比例体细胞突变
- 遗传病基因 Panel 或 WES，评估目标基因覆盖是否满足判读要求
- 新设计的捕获探针或引物池，评估捕获效率和覆盖均一性
- 批量样本测序后，筛出捕获失败或覆盖不足的样本
- 需要列出低覆盖区域，说明哪些位点的阴性结果不可靠
- 带 UMI 的高深度 Panel，需要生成一致性读段降低错误背景
不适合的情况
- 想发现 Panel 以外区域的新致病基因：靶区之外几乎没有数据
- 用小 Panel 估计全基因组层面的指标而不做校正，如直接外推拷贝数或突变负荷
- 对扩增子数据按坐标标记重复并删除：会把绝大多数有效读段当作重复去掉
需要准备的数据
- 测序数据
- 双端 FASTQ 或已比对 BAM；带 UMI 的文库需说明 UMI 在读段中的位置或所在的 index 读段。
- 靶区 BED 文件
- 探针区域（bait）和目标区域（target）最好分别提供；BED 为 0 起始坐标，参考基因组版本须与比对一致。
- 引物信息
- 扩增子 Panel 需要引物位置 BED，用于比对后切除引物序列，避免引物区掩盖真实变异。
- 样本信息
- 样本类型（组织、FFPE、血浆）、是否有配对正常样本、预期检测下限，决定变异检测工具和过滤策略。
分析步骤
- 1
读段预处理
完成接头修剪和质控；有 UMI 时先把 UMI 提取到读段名或标签中。FFPE 样本插入片段常偏短，接头读通比例高，修剪不彻底会降低比对率和 on-target 率。
- 2
比对与去重
用 BWA-MEM 比对到参考基因组。杂交捕获数据按坐标标记 PCR 重复；扩增子数据不能按坐标去重，应保留全部读段或使用 UMI；有 UMI 时按 UMI 分组生成一致性读段。
- 3
引物切除
扩增子数据比对后按引物 BED 切除或软剪切引物序列，常用 iVar trim 或 fgbio 相关工具。引物区的碱基来自合成引物而非模板，不切除会掩盖引物结合区的真实变异。
- 4
捕获效率评估
用 Picard CollectHsMetrics 计算 on-target 比例、平均靶区深度、Fold-80、各深度覆盖比例和 GC、AT 丢失指标。同批样本 on-target 率明显偏低的样本，多为捕获或建库失败。
- 5
区域覆盖统计
用 mosdepth 或 bedtools 按外显子、基因和扩增子统计深度，列出低于判读阈值的区域。重复出现低覆盖的区域，多为高 GC、重复序列或探针设计问题，应在报告中注明。
- 6
变异检测
胚系变异可用 GATK HaplotypeCaller，体细胞突变可用 Mutect2、VarDict 或 LoFreq，按样本是否有配对正常选择模式。检测时用靶区 BED 加适当外延限定区域，避免靶外低深度区域的噪声。
- 7
注释与报告
注释变异的基因、转录本和功能影响，同时在报告中附上覆盖度统计和低覆盖区域列表。没有检出变异时，应说明该位点深度是否达到检测下限。
关键参数与决策
判读深度阈值
胚系检测常用 20× 作为最低判读深度，低比例体细胞突变检测需要数百到上千倍，这些都是经验值。阈值应根据目标检测下限和测序误差率确定，并用对应深度的覆盖比例作为样本合格标准。
靶区外延（padding）
外显子 Panel 检测时常在靶区两侧各扩展数十到一百左右碱基，以纳入剪接位点和探针边缘的读段。外延过大会引入低深度区域的噪声变异，过小会漏掉剪接区变异。
去重策略
杂交捕获按坐标去重；扩增子不按坐标去重；有 UMI 时按 UMI 和坐标分组，并设置一致性读段需要的最少原始读段数。最少读段数越高错误率越低，但有效深度也会下降。
Bait 与 Target 区间
Picard 需要分别提供探针区间和目标区间，均为 interval_list 格式，可用 BedToIntervalList 从 BED 转换。只有一个 BED 时可两处共用，但 on-bait 与 on-target 指标将无法区分。
低频变异过滤
设置最低变异等位基因比例、支持读段数和链偏好过滤。FFPE 样本的 C>T 脱氨损伤会产生低比例假突变，阈值需要相应提高，或利用双链 UMI 一致性降低此类错误。
常见错误
- 扩增子数据按坐标去重：同一扩增子的读段起止位置相同，绝大部分会被标记为重复，深度被严重低估。
- BED 文件参考版本与比对版本不一致：靶区坐标整体偏移，on-target 率异常低，覆盖统计完全失真。
- 只看平均深度不看均一性：平均 500× 的样本也可能有相当比例的靶区低于 50×，这些区域的阴性结果不可靠。
- 扩增子数据不切引物：引物结合区的碱基全部来自引物，真实变异被参考碱基覆盖而漏检。
- FFPE 样本直接按新鲜组织阈值报告低频 C>T 突变：甲醛损伤造成的假突变会被当作真实体细胞事件。
- 靶区外的变异与靶区内同等对待：靶外深度低且不均匀，检出的变异大多不可靠，应只在靶区和外延范围内报告。
结果怎么看
HsMetrics 捕获效率表
看 on-target 比例、平均靶区深度、PCT_TARGET_BASES_20X 等覆盖比例和重复率。on-target 低且重复率高，常见于起始 DNA 不足；on-target 低但重复率正常，多为捕获问题。
Fold-80 碱基惩罚
表示要让 80% 靶区碱基达到当前平均深度，还需额外测多少倍数据，数值越接近 1 越均匀。数值明显升高说明覆盖不均，通常与 GC 偏好或扩增过度有关。
靶区深度分布图
横轴是深度，纵轴是靶区碱基比例，或展示各靶区深度的箱线图。曲线左侧拖尾长说明存在一批低覆盖区域，需结合低覆盖区域表定位。
低覆盖区域列表
列出深度低于阈值的外显子或扩增子及其基因、坐标和平均深度。多个样本在相同区域低覆盖属于 Panel 设计或序列特性问题；只在个别样本出现则多与样本质量有关。
GC 偏好图
展示不同 GC 含量区域的归一化覆盖度。高 GC 或高 AT 区域覆盖骤降，会导致对应外显子的变异漏检；Picard 的 GC_DROPOUT 和 AT_DROPOUT 可作为量化指标。
和相近方法怎么选
杂交捕获与扩增子 Panel
杂交捕获覆盖区域大、均一性较好，可按坐标去重，适合几十到几百个基因及 WES；扩增子起始量要求低、流程快，适合少量热点区域，但不能按坐标去重，引物区变异易漏检，且等位基因可能因引物结合位点变异而扩增失败。
靶向 Panel 与 WES
Panel 深度高、成本低、解读集中，适合已知基因和低比例突变；WES 覆盖全部编码区，能发现 Panel 以外的新基因，但单位区域深度较低。已知致病基因明确时用 Panel，表型不典型或需要新发现时用 WES。
靶向测序与全基因组测序
WGS 覆盖更均匀，能检测结构变异、非编码区和拷贝数，但深度通常只有 30× 左右，难以检测低比例突变。追求低频检测灵敏度选靶向测序，追求变异类型和区域的完整性选 WGS。
常见问题
on-target 率多少算正常？
与 Panel 大小、探针设计和建库方式有关，没有统一数值。小 Panel 的 on-target 率通常低于大 Panel，因为靶区本身占比小。实践中更常用同一 Panel 历史批次的分布作为参照，显著低于历史水平的样本需要排查。
Fold-80 base penalty 怎么理解？
它衡量覆盖均一性：数值为 1 表示所有靶区深度完全相同，数值为 2 表示需要再测一倍的数据才能让 80% 的靶区碱基达到当前平均深度。数值越大越不均匀，意味着要达到同样的覆盖比例需要更多测序量。
扩增子测序数据要不要去重？
不要按坐标去重。扩增子的读段都起止于引物位置，坐标去重会删除绝大多数有效数据。如果文库带 UMI，可以按 UMI 合并来自同一原始分子的读段，这样既能去除 PCR 重复，又能降低测序错误。
Panel 测序深度应该多深？
取决于要检测的最低等位基因比例。胚系杂合变异在数十倍深度下即可可靠检出；组织体细胞突变常要求数百倍以上；血浆 ctDNA 低频检测则需要上千倍甚至更高的原始深度并结合 UMI。
Picard CollectHsMetrics 需要哪些文件？
需要按坐标排序的 BAM、参考基因组，以及探针区间和目标区间两个 interval_list 文件，后者可由 BED 转换得到。输出表格中包含 on-target、平均靶区深度、各深度覆盖比例、Fold-80、GC 和 AT 丢失等指标。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 Panel 测序数据和靶区 BED 并说明建库方式后，会先确认分析方案，然后完成比对、去重或引物处理与变异检测，同时评估捕获效率与覆盖度，计算 on-target 率、平均靶区深度、覆盖均一性和各深度覆盖比例，列出低覆盖区域。交付变异结果表、捕获效率与覆盖度统计表、深度分布和低覆盖区域图表、分析报告和可复现脚本。
我有 48 个肿瘤样本的 300 基因杂交捕获 Panel 数据和靶区 BED，想评估每个样本的捕获效率和覆盖均一性，并做体细胞突变检测