ctDNA 低频突变检测与 MRD 监测
循环肿瘤 DNA（ctDNA）是肿瘤细胞释放到血液中的 DNA 片段，混在主要来自造血细胞的游离 DNA（cfDNA）里。cfDNA 长度集中在约 167 bp，ctDNA 片段往往更短。晚期患者血浆 ctDNA 比例可达百分之几，而术后微小残留病灶（MRD）检测面对的是万分之一甚至更低的比例，低于常规测序错误率。分析核心是降噪：用 UMI 把同一原始分子的 reads 合成共识序列，建立位点背景错误模型，并排除克隆性造血突变。本页为科研方法介绍，结果不替代临床诊断和治疗决策。
什么时候用
- 术后或治疗后的 ctDNA 动态监测，研究其与复发的关系
- 晚期肿瘤血浆基因分型，补充组织活检的突变谱
- 治疗过程中耐药突变出现与克隆演化的研究
- 评估新辅助治疗或免疫治疗早期的 ctDNA 应答
- 比较肿瘤知情 MRD 与固定 Panel 方案的检测灵敏度
不适合的情况
- 未加 UMI 的普通测序数据检测千分之一以下的突变：测序错误与信号处于同一量级
- 没有白细胞对照时判断 DNMT3A、TET2 等基因突变的来源：容易与克隆性造血混淆
- 凭单次检测阴性断定无残留病灶：受采血量和检测下限限制，阴性不等于无病
需要准备的数据
- 血浆 cfDNA 测序数据
- 带 UMI 的 FASTQ，需明确 UMI 位于 read 内还是索引中、长度与结构，以及是否支持 duplex
- 配对白细胞或肿瘤组织数据
- 白细胞用于识别胚系变异和克隆性造血；肿瘤组织 WES 用于肿瘤知情 MRD 选择追踪位点
- 采样与建库信息
- 采血管类型、采血到分离血浆的时间、血浆体积和 cfDNA 投入量，它们决定可检测的分子数
- 靶向区域或追踪位点
- Panel 的 BED 文件，或个体化追踪的突变位点列表，坐标版本与参考基因组一致
- 健康人血浆数据（推荐）
- 用同一流程处理的阴性样本，用于估计每个位点的背景错误率和假阳性率
分析步骤
- 1
预处理与 UMI 提取
从 reads 中提取 UMI 写入标签，去除接头和低质量碱基后比对。检查 cfDNA 片段长度分布，应在约 167 bp 处有主峰；长片段比例偏高提示白细胞裂解释放了基因组 DNA。
- 2
UMI 分组与共识
用 fgbio 等工具按比对位置和 UMI 将 reads 分组，容忍 UMI 中少量错配；每组生成单链共识，duplex 设计再合并正反两条链。查看分子家族大小分布判断测序是否饱和。
- 3
共识过滤与再比对
过滤家族过小、共识质量低的分子，把共识 reads 重新比对。统计去重后的独特分子深度，这才是决定灵敏度的有效深度，而不是原始 reads 深度。
- 4
低频突变检测
在共识 BAM 上检测低频变异，用健康血浆建立的位点背景错误率判断突变信号是否显著高于噪声。每个突变报告突变分子数、总分子数和等位基因频率。
- 5
排除胚系与克隆性造血
与配对白细胞数据比对，去掉白细胞中同样存在的变异。DNMT3A、TET2、ASXL1 等基因上的低频突变要重点核对，避免把造血来源的突变误归为肿瘤来源。
- 6
MRD 判定
肿瘤知情方法追踪组织中检出的多个患者特异突变，合并各位点的突变分子做统计检验，给出阳性或阴性及估计的 ctDNA 比例；非知情方法依赖固定 Panel、甲基化或片段特征。
- 7
动态分析
按时间点汇总 ctDNA 比例或每毫升血浆突变分子数，绘制随治疗变化的曲线，并与手术、用药、影像学评估和复发时间对照，观察清除与再升高的时间关系。
关键参数与决策
最小家族大小
单链共识常要求每个分子至少 2 到 3 条 reads，duplex 要求两条链都有支持。要求越严错误越少，但可用分子数随之下降，需要在灵敏度与特异度之间权衡。
位点背景错误率
同一流程下不同位点的背景错误率可相差数量级，统一的 VAF 阈值并不合适。应按位点建立背景分布，再用二项或泊松等检验判断观测信号是否超出背景。
cfDNA 投入量与检测下限
1 ng 人基因组 DNA 约含 300 个单倍体基因组拷贝，20 ng 约为 6000 个。比例为万分之一时，单个位点期望不到一个突变分子，所以低比例 MRD 必须追踪多个位点或增加采血量。
追踪位点数量与选择
肿瘤知情方法追踪的位点越多，合并检出概率越高。通常优先选择组织中 VAF 较高的克隆性突变，避开克隆性造血相关基因和背景错误率高的位点。
阳性判定规则
可要求至少两个位点检出，或合并统计量超过预设阈值，并用健康人样本估计假阳性率。判定规则应在分析前确定，不要看到结果后再调整。
常见错误
- 把原始 reads 深度当作检测深度：去重后的独特分子数可能只有原始深度的一小部分，按 reads 深度估算灵敏度会严重高估。
- 不测配对白细胞：老年患者常见的克隆性造血突变会出现在血浆中，被当作肿瘤突变后导致 MRD 假阳性或错误的克隆演化结论。
- EDTA 管采血后长时间不分离血浆：白细胞裂解释放的基因组 DNA 会稀释 ctDNA 比例，造成假阴性。
- 所有位点用同一个 VAF 阈值：高错误率位点假阳性多，低错误率位点又被过严的阈值漏检，整体灵敏度和特异度都下降。
- 混用不同 Panel 或流程的结果画动态曲线：各自的灵敏度和背景不同，数值变化可能来自技术差异，而非肿瘤负荷变化。
结果怎么看
片段长度与家族大小分布
cfDNA 长度主峰约 167 bp，短片段一侧常见约 10 bp 周期的小峰。家族大小分布反映测序饱和程度；多数家族只有 1 条 reads，说明测序深度不足以形成可靠共识。
突变检测表
列出每个突变的突变分子数、总分子数、VAF、该位点背景错误率、统计显著性以及在白细胞中的状态。只有 1 个突变分子支持的检出需谨慎，结合背景和多位点证据判断。
MRD 判定结果
每个时间点的阳性或阴性、检出位点数和估计的 ctDNA 比例。阴性结果要同时报告该样本的独特分子数和理论检测下限，下限不足时阴性结论缺乏解释力。
ctDNA 动态曲线
横轴为时间，纵轴为 ctDNA 比例或每毫升血浆突变分子数，常用对数刻度，并标注手术、治疗和影像评估节点。持续阴性、清除后再次升高等模式是研究中常关注的特征。
和相近方法怎么选
肿瘤知情与非知情 MRD
肿瘤知情方法先测肿瘤组织再追踪个体特异突变，灵敏度高，但需要组织样本和定制周期；非知情方法用固定 Panel、甲基化或片段特征，无需组织、周转快，低肿瘤负荷时灵敏度通常较低。
ctDNA 检测与组织体细胞突变分析
组织测序肿瘤比例高、突变频率高，适合完整的突变谱和突变特征分析；ctDNA 反映全身肿瘤的综合信息，可以多次取样观察动态，但突变频率低，降噪是分析关键。
单链 UMI 共识与 duplex 共识
单链共识能去除 PCR 和测序引入的随机错误，但无法去除建库前单条链上的损伤；duplex 要求正反两条链一致，错误率可进一步降低数个数量级，代价是可用分子数明显减少。
常见问题
UMI 是什么，为什么 ctDNA 测序需要它？
UMI 是建库时给每个原始 DNA 分子加上的随机短序列标签。测序后带相同 UMI 和比对位置的 reads 来自同一分子，可以合并成共识序列，去掉 PCR 扩增和测序引入的随机错误，使千分之一以下的突变能与噪声区分开。
ctDNA 的检测下限能到多少？
取决于投入的 cfDNA 分子数、追踪位点数和背景错误率，而不只是测序深度。单个位点受可用分子数限制；合并多个位点的肿瘤知情方法在研究中可检测到万分之一甚至更低的比例，但每个样本的实际下限需单独计算。
MRD 阴性能说明不会复发吗？
不能。阴性只说明在这次采血和这个检测下限下没有检出 ctDNA，残留负荷极低或向血液释放 DNA 较少的病灶（如部分颅内病灶）都可能检测不到。研究中通常结合多次连续检测和影像随访解读。
克隆性造血突变怎么排除？
最可靠的做法是同时测序配对白细胞，在白细胞中以相近频率出现的突变判为造血来源。没有白细胞数据时，可参考常见克隆性造血基因列表和肿瘤组织结果辅助判断，但无法完全排除。
ctDNA 检测用什么采血管？
EDTA 管需在采血后较短时间内分离血浆；含细胞稳定剂的专用 cfDNA 采血管允许更长的运输时间。血浆通常经两步离心去除细胞，分离后冻存并避免反复冻融，采血管类型应在研究中保持一致。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式中说明 UMI 结构、是否 duplex、采样时间点和有无白细胞数据，Codar 会先确认方案，再完成 cfDNA 预处理与 UMI 共识、ctDNA 低频突变检测，并汇总各时间点做 ctDNA 动态与 MRD 判定。交付突变表、MRD 结果、动态曲线、报告和可复现脚本。
我有 20 例结直肠癌术后患者 4 个时间点的血浆靶向测序数据，带 duplex UMI 和配对白细胞，想检测低频突变并画 ctDNA 动态曲线。