GWAS 全基因组关联分析
全基因组关联分析（GWAS）在成千上万个个体中逐个检验全基因组的 SNP，看哪些位点的等位基因频率或剂量与表型相关。表型可以是身高、血脂这类连续性状，也可以是病例-对照形式的疾病状态。典型输入是 SNP 芯片或测序得到的基因型（PLINK bed/bim/fam、VCF、BGEN）加上表型和协变量表。GWAS 的产出是每个位点的效应值、标准误和 P 值，也就是常说的汇总统计（summary statistics）。它告诉你哪些区域与表型统计相关，但显著位点通常是一段连锁不平衡区间的代表，不等于致病变异，后续需要精细定位、共定位或功能实验才能落到具体基因。
什么时候用
- 有数千例以上带基因型的样本，想找与某个性状或疾病相关的遗传位点
- 拿到 UK Biobank、FinnGen 等队列的个体数据，做新表型的关联扫描
- 已有芯片数据，想在填充后对新表型补做全基因组扫描
- 需要产出标准格式的汇总统计，供 MR、PRS、共定位等下游分析使用
- 检验候选区域在更大样本中是否重复出显著信号
不适合的情况
- 样本只有几十到几百例：全基因组多重校正下几乎不可能检出常见变异的小效应
- 想找罕见变异的作用：单变异检验效力不足，应改用基因水平的负荷检验（burden、SKAT）
- 把显著 SNP 直接当成致病变异或目标基因写进结论
需要准备的数据
- 基因型文件
- PLINK bed/bim/fam、pgen 或 VCF/BGEN；确认基因组版本（GRCh37 或 GRCh38）并统一染色体命名
- 表型文件
- 样本 ID 与基因型文件一致；连续性状看分布是否严重偏态，二分类需标清病例与对照编码
- 协变量表
- 常含年龄、性别、基因型批次和前若干个遗传主成分；缺失值需提前处理，否则样本会被整行剔除
- 填充参考面板（可选）
- 芯片数据通常先做填充，常用 1000 Genomes 或 TOPMed 面板；上传前需完成位点质控和链方向校正
分析步骤
- 1
样本质控
剔除检出率低（如 PLINK --mind 0.02–0.05）、遗传性别与登记性别不符、杂合度偏离均值超过约 3 个标准差的样本。用 KING 或 PLINK 估计亲缘关系，非混合模型分析时每对近亲只留一人。剔除比例异常高时先查批次问题。
- 2
位点质控
常用过滤：位点检出率 --geno 0.02–0.05、次等位基因频率 --maf 0.01（视样本量调整）、对照组 Hardy-Weinberg 检验 P 低于 1e-6 左右的位点剔除。病例组的 HWE 偏离可能是真实关联信号，不建议用同一阈值。
- 3
群体分层评估
做 LD 剪枝后计算主成分，与 1000 Genomes 等参考群体一起投影，剔除祖源明显离群的样本。前若干个主成分作为协变量进入模型；如果病例和对照在 PC 图上分开，说明分层会带来假阳性。
- 4
基因型填充
芯片数据常用 Minimac4、Beagle 或在线填充服务补全未分型位点，填充前需按参考面板统一位点、等位基因和链方向。填充后按填充质量（INFO 或 R²）过滤，常见阈值 0.3 到 0.8，阈值越高位点越少但越可靠。填充质量要和 MAF 一起看，低频位点的质量通常更差。
- 5
关联检验
无亲缘样本可用 PLINK 2 的 --glm 线性或 logistic 回归；含亲缘关系或样本量很大时用混合模型或其近似方法，如 REGENIE、SAIGE、BOLT-LMM、GCTA-fastGWA。运行后检查 λGC 和 QQ 图，判断是否有残余膨胀。
- 6
信号整理
以 5e-8 为全基因组显著阈值，用 PLINK --clump 按 LD 把显著位点归并为独立信号，再用 LocusZoom 风格的区域图展示每个位点。条件分析（如 GCTA-COJO）可判断一个区域内是否存在多个独立信号。
- 7
汇总统计标准化
统一列名（SNP、CHR、BP、EA、OA、BETA、SE、P、EAF、N）、效应等位基因、基因组版本和 rsID，剔除重复与回文歧义位点前做记录。标准化后的文件才能直接用于 MR、PRS 和共定位。
关键参数与决策
MAF 过滤阈值
样本量越小，低频位点的检验越不稳定。几千例样本常用 0.01，数十万例可下探到 0.001。二分类表型还要看病例组中的次等位基因计数，计数过少时 logistic 回归的估计不可靠。
协变量与主成分个数
常见做法是纳入年龄、性别和前 10 个左右的主成分。可以先看各主成分与表型的关联，再决定个数；纳入与表型因果相关的中间变量会削弱或扭曲信号。
线性模型还是混合模型
样本含亲属或存在隐性亲缘时，普通回归会膨胀统计量；混合模型用遗传关系矩阵吸收这部分相关。病例占比很低的二分类表型，SAIGE 和 REGENIE 用鞍点近似或 Firth 校正控制 I 类错误。
显著性阈值
5e-8 来自对欧洲人群常见变异独立检验数的估计，是常用约定。1e-5 常被称为提示性阈值，只用于挑选随访位点，不能当作显著结果报告。
clump 参数
PLINK --clump 的关键是 r² 阈值和窗口大小。整理独立 GWAS 信号时常用 r² 0.1、窗口 250 kb 到 1 Mb；LD 参考样本的祖源应与研究人群一致，否则会合并或拆散错误的信号。
常见错误
- 不做主成分校正：病例和对照祖源构成不同时，频率差异来自祖源而非疾病，曼哈顿图上会出现大量假阳性峰。
- 对照组和病例组分批次、分芯片分型：批次差异会伪装成关联信号，QQ 图整体上翘，显著位点集中在填充质量差的区域。
- 填充后不按 INFO 过滤：低质量填充位点的基因型剂量不准确，效应估计偏差很大，曼哈顿图上孤立的单点高峰常常就是这类位点，看到这种峰应先回查它的填充质量和 MAF。
- 混用 GRCh37 和 GRCh38 坐标：与外部汇总统计或注释合并时位置错位，区域图、共定位和 MR 都会得到错误结果。
- 把单个最显著 SNP 所在的基因当作因果基因：信号区间可能横跨多个基因，最近基因只是一个起点。
- 表型分布严重偏态仍直接做线性回归：极端值主导估计，可考虑秩逆正态变换后再分析，并在方法中说明。
结果怎么看
曼哈顿图
横轴是染色体位置，纵轴是 -log10(P)。真实信号通常是一座由多个 LD 相关位点组成的塔形峰；只有一个孤立点冲高时，先查该位点的填充质量、MAF 和基因型簇图。红色虚线一般标在 5e-8。
QQ 图与 λGC
点沿对角线分布、只在尾部上翘，说明多数位点无关联、少数有真实信号。整条曲线从一开始就偏离对角线，λGC 明显大于 1，提示分层或亲缘未校正。多基因性状在大样本中 λGC 自然偏高，可用 LD score 回归截距区分。
独立显著位点表
列出 clump 后每个独立信号的 lead SNP、效应等位基因、频率、效应值、标准误和 P 值，以及区间内的基因。效应方向要和效应等位基因一起看，换了参考等位基因符号会反转。
区域关联图
以 lead SNP 为中心展示周围位点的 P 值，颜色表示与 lead SNP 的 r²。高 r² 位点同步升高说明信号可信；如果高峰中混着大量低 r² 的显著位点，可能存在多个独立信号。
和相近方法怎么选
GWAS 与候选基因关联研究
候选基因研究只检验预先挑选的少数位点，多重校正负担小，但历史上重复性较差。GWAS 不预设假设，用严格阈值控制假阳性，更适合发现新位点；已有强先验时，候选位点可作为 GWAS 结果的验证。
PLINK --glm、REGENIE 与 SAIGE
PLINK 适合无亲缘、样本量中等的数据，速度快、易上手。REGENIE 两步法适合生物样本库级别的数据和多表型批量分析。SAIGE 在病例极少的二分类表型上对 I 类错误控制更稳。按亲缘结构和病例比例选择。
单变异 GWAS 与基因负荷检验
单变异检验适合常见变异，每个位点单独估计效应，方法简单、结果易解释。罕见变异（MAF 低于 1% 左右）单独检验效力不足，负荷检验和 SKAT 把同一基因内的罕见变异按权重合并成一个检验单位，更适合外显子或全基因组测序数据。两类分析常在同一份数据上互为补充。
常见问题
GWAS 需要多少样本？
没有统一门槛，取决于效应大小、等位基因频率和表型类型。常见复杂性状单个位点效应很小，往往需要上万甚至数十万样本才能稳定检出；几百例样本多用于效应较大的性状或作为验证队列。做之前可以用功效计算工具按预期效应估算。
λGC 多大算有问题？
λGC 接近 1 说明统计量无明显膨胀。中小样本中明显大于 1.1 常提示分层、亲缘或批次未处理好。大样本多基因性状的 λGC 会因真实多基因信号而升高，这时看 LD score 回归截距更合适，截距接近 1 说明膨胀主要来自多基因性。
为什么全基因组显著阈值是 5e-8？
它相当于对约一百万次独立检验做 Bonferroni 校正，独立检验数来自对欧洲人群常见变异 LD 结构的估计。非洲人群 LD 更短、或纳入大量罕见变异时，有研究建议使用更严格的阈值。
曼哈顿图怎么画？
R 中常用 qqman 包的 manhattan() 和 qq() 函数，输入只需 CHR、BP、P 和 SNP 四列；需要更灵活的样式可用 ggplot2 自己按染色体累积坐标作图。点很多时先把 P 值大于 0.01 的位点抽稀，可显著减小图片体积。
GWAS 找到显著位点后下一步做什么？
常见路线是：用条件分析和精细定位缩小可信变异集，用 eQTL 共定位推断目标基因，用功能注释判断变异位于启动子还是增强子，再用孟德尔随机化看暴露与结局的因果关系，最后回到实验验证。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里描述表型、样本来源和协变量后，会先确认分析方案，再对基因型与表型数据做样本和位点质控（检出率、MAF、HWE、亲缘与祖源离群），运行全基因组关联检验，最后对汇总统计做质控和格式标准化，统一效应等位基因与列名。交付曼哈顿图、QQ 图与 λGC、独立显著位点表、标准化汇总统计文件、分析报告和可复现脚本。
我有 3000 例 2 型糖尿病病例和 5000 例对照的芯片数据（PLINK 格式），想做 GWAS，校正年龄、性别和前 10 个主成分，画曼哈顿图和 QQ 图