稀有变异关联分析（Burden、SKAT）
频率低于 1% 左右的稀有变异往往效应更大，但单个变异的携带者太少，逐个检验几乎没有统计效力。稀有变异关联分析把同一个基因（或其他功能单元）内的多个稀有变异合并检验。最常用的两类方法是负荷检验（burden）和方差成分检验（SKAT）：负荷检验把每个人在该基因中携带的稀有变异合成一个分数，假设它们作用方向一致；SKAT 允许变异效应方向和大小各不相同。SKAT-O 在两者之间自适应取舍，ACAT 则用柯西分布组合多个 P 值。典型数据是全外显子或全基因组测序的联合检测 VCF 加表型和协变量，生物样本库规模的数据常用 REGENIE 或 SAIGE-GENE。
什么时候用
- 有数千例以上外显子或全基因组测序数据，想找与疾病或性状相关的基因
- 常见变异 GWAS 已做过，想检验是否有稀有编码变异贡献
- 评估某个候选基因的功能缺失变异负荷是否在病例中富集
- 在生物样本库中做全外显子组的基因层面关联扫描
- 验证药物靶点基因功能缺失是否与保护性表型相关
不适合的情况
- 只有芯片或填充数据：稀有变异的检出和填充准确度不足以支撑基因层面检验
- 单个家系或少数先证者的致病基因诊断：更适合家系共分离和罕见病诊断流程
- 病例和对照来自不同测序平台或捕获试剂且无法统一处理的数据
需要准备的数据
- 联合检测的 VCF
- 病例与对照应一起做联合变异检测并统一质控；分开检测再合并会引入批次差异
- 变异注释
- 每个变异的基因、转录本和功能后果，以及致病性预测分数，用于划分功能缺失、错义等类别
- 表型与协变量
- 二分类或连续表型，协变量含年龄、性别、主成分和测序批次；样本 ID 与 VCF 一致
- 分组文件
- 定义每个基因包含哪些变异以及各变异属于哪个掩码，需与所用软件的格式要求一致
分析步骤
- 1
变异与样本质控
按测序深度、基因型质量、检出率过滤变异和样本，剔除近亲、性别不符和祖源离群样本。比较病例与对照在目标区域的平均覆盖度，只保留两组覆盖都充分的区域，这一步决定结果能否可信。
- 2
功能注释
用 VEP 等工具注释变异的功能后果，标记高置信度功能缺失变异（如用 LOFTEE 过滤），并为错义变异加上致病性预测分数。注释时固定一个转录本选择规则，如 MANE 或规范转录本，避免同一变异在不同转录本下后果不一。
- 3
构建变异掩码
常见掩码包括只含功能缺失变异、功能缺失加预测有害的错义变异、全部非同义变异，并在 1%、0.1% 等多个 MAF 上限下分别构建。同义变异掩码通常作为阴性对照，它不应出现大量显著基因。
- 4
拟合零模型
以表型对协变量建立不含遗传效应的零模型。样本有亲缘关系或规模很大时用混合模型类工具。二分类且病例比例很低时，选择有鞍点近似或 Firth 校正的方法，避免 I 类错误膨胀。
- 5
基因层面检验
在每个基因、每个掩码上运行 burden、SKAT 和 SKAT-O，可用 ACAT 合并多个掩码和方法的 P 值。剔除累计携带者数过少的基因组合，它们几乎没有检验效力，只会增加多重校正负担。
- 6
显著基因复核
对显著基因做留一变异分析，看信号是否由单个变异驱动；比较病例与对照中各变异的携带情况和测序深度；检查同义变异掩码是否同样显著。必要时在独立队列中重复。
关键参数与决策
MAF 上限
上限越低，掩码越聚焦于效应可能更大的极罕见变异，但携带者更少。常同时运行 1%、0.1%、0.01% 等多个阈值，再用 ACAT 合并或分别报告。频率应在全体样本中计算，而不是只在对照中。
变异权重
R 包 SKAT 默认按 MAF 使用 Beta(1,25) 权重，越稀有的变异权重越大。也可以用功能预测分数加权，或在负荷检验中等权。权重设定反映对效应结构的假设，应在方法中说明。
Burden、SKAT 还是 SKAT-O
若相信基因内多数变异都是同向有害，负荷检验效力最高；若可能混有保护性和中性变异，SKAT 更合适。不确定时用 SKAT-O，它在 R 包 SKAT 中通过 method 参数选择 optimal.adj 运行。
显著性阈值
外显子组分析常以约两万个蛋白编码基因做 Bonferroni 校正，得到约 2.5e-6 的经验阈值。同时检验多个掩码和方法时实际检验数更多，可在合并后的 P 值上应用该阈值，或进一步校正掩码数。
最低携带者数
基因中累计携带者过少（如个位数）时，渐近检验不准且无效力。常见做法是设定最小累计次等位基因计数，剔除不满足的组合，并在结果中报告实际检验的基因数。
常见错误
- 病例和对照来自不同测序项目：捕获区域和覆盖深度不同，病例中检出的稀有变异更多或更少，会产生大量假阳性基因。
- 只用常见变异主成分校正分层：稀有变异的分布比常见变异更依赖细分的祖源，残余分层可能需要稀有变异主成分或更严格的祖源限定。
- 掩码中混入低置信度的功能缺失变异：位于末端外显子或注释错误的变异实际不导致功能缺失，会稀释真实信号。
- 小样本二分类分析不做小样本校正：SKAT 的渐近 P 值在病例很少时偏离，I 类错误可能膨胀或过于保守。
- 只报告最显著的掩码和方法：多次尝试不同组合而不校正，显著结果的可信度被高估。
- 显著基因只靠一个变异驱动：这种结果更接近单变异关联，需要单独检查该变异的分型质量。
结果怎么看
基因层面 QQ 图
按掩码分别绘制，大多数基因应沿对角线，只有少数尾部上翘。同义变异掩码的 QQ 图也明显膨胀，说明存在批次、覆盖度或分层问题，需要先回头处理再解读其他掩码。
基因关联结果表
每行一个基因与掩码组合，列出纳入变异数、累计携带者数、burden 效应方向、各方法 P 值和合并 P 值。优先关注多个掩码一致显著且携带者数充足的基因。
变异分布棒棒糖图
沿蛋白质序列标出显著基因中各变异的位置，用颜色区分病例与对照携带者。病例变异集中在某个功能结构域，支持生物学合理性；变异均匀分布且病例对照混杂，信号更可能来自技术因素。
留一变异分析表
逐一去掉一个变异后重新检验，记录 P 值变化。去掉某个变异后信号消失，说明结果由它主导，应单独核查其分型质量和频率；P 值变化不大则信号分布在多个变异上，更符合基因层面关联。
和相近方法怎么选
Burden 检验与 SKAT
负荷检验把基因内变异合成一个分数，同向效应时效力最高，混有保护性或中性变异时效力明显下降。SKAT 检验变异效应的方差，对效应方向不敏感，但在全部同向时效力不如负荷检验。不知效应结构时用 SKAT-O 兼顾。
SKAT 与 ACAT
SKAT 和负荷检验对少数强效变异加上大量中性变异的情形效力有限。ACAT 用柯西组合合并变异或检验的 P 值，在只有极少数变异起作用时效力较好，也常用来合并多个掩码与方法的结果，计算快且不需要估计相关结构。
稀有变异关联与家系共分离分析
稀有变异关联在大样本病例对照中寻找基因层面的统计富集，适合复杂疾病。家系共分离看变异是否随疾病在家系中传递，适合单基因病的致病基因确认。前者需要数千例样本，后者依赖家系结构。
常见问题
SKAT 和 SKAT-O 有什么区别？
SKAT 是方差成分检验，对变异效应方向不作假设。SKAT-O 在负荷检验和 SKAT 之间寻找最优组合，用一个参数控制两者的比例并做相应校正。如果事先不知道基因内变异的效应是否同向，SKAT-O 通常是更稳妥的默认选择。
稀有变异关联分析需要多少样本？
取决于基因的累计携带频率和效应大小。功能缺失变异在多数基因中极其罕见，常需要上万例样本才能在外显子组水平达到显著。几百例样本的研究通常只适合候选基因分析或作为验证队列。
MAF 阈值设 1% 还是 0.1%？
两者回答的问题不同。0.1% 及以下更聚焦于可能受强负选择、效应较大的变异；1% 包含更多变异，携带者更多但可能稀释信号。通常两个阈值都做，用 ACAT 合并或分别报告，并在方法中写明。
病例对照来自不同测序批次怎么办？
最好把所有样本一起做联合变异检测，并只保留两组覆盖都充分的区域。可以把批次放入协变量，并用同义变异掩码检查残余偏倚。同义变异掩码也大量显著时，说明批次问题没有解决，结果不可解读。
REGENIE 和 SAIGE-GENE 适合什么场景？
两者都面向生物样本库规模的数据，支持亲缘样本和病例比例极低的二分类表型，能在一次运行中检验多个掩码和 MAF 阈值。中等规模、无亲缘的数据用 R 包 SKAT 即可；数十万样本的外显子组分析通常选择这类工具。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供联合检测的 VCF、表型和协变量，说明关注的基因范围和变异类型，会先确认掩码定义、MAF 阈值和检验方法，然后完成变异与样本质控、功能注释、掩码构建，运行 burden、SKAT、SKAT-O 并合并 P 值，对显著基因做留一变异分析和同义变异对照检查。交付基因层面 QQ 图、关联结果表、变异分布图、分析报告和可复现脚本。
我有 2000 例早发冠心病和 3000 例对照的外显子测序 VCF，想做稀有变异负荷分析，比较功能缺失和有害错义变异两种掩码，用 SKAT-O 检验