基因型填充与相位推断
SNP 芯片通常只直接检测几十万到上百万个位点，而人类基因组中的常见变异有千万量级。基因型填充（imputation）利用已测序参考面板中的单倍型，根据研究样本在已分型位点上的模式，推断未分型位点的基因型。填充前需要先做相位推断（phasing），把每个个体的基因型拆成父源和母源两条单倍型。填充能把不同芯片的数据统一到同一组位点上，便于荟萃分析，也能提高精细定位的分辨率。常用组合是 SHAPEIT 或 Eagle 定相加 Minimac4 填充，或用 Beagle 一体完成，也可使用 Michigan、TOPMed 等在线服务；低深度全基因组测序数据则常用 GLIMPSE 等基于基因型似然的方法。
什么时候用
- 芯片数据做 GWAS 前，把位点从几十万扩展到数百万以上
- 多个队列用了不同芯片，需要统一到同一套位点后合并或做荟萃分析
- 要做精细定位、PRS 或 MR，需要的位点在芯片上不存在
- 低深度全基因组测序数据，想得到可用于关联分析的基因型
- 需要个体单倍型用于单倍型分析、选择信号或祖源推断
不适合的情况
- 参考面板中没有与研究人群相近的样本：填充准确率会明显下降，尤其是低频位点
- 想用填充结果研究面板中很少见的稀有变异：填充对稀有变异的准确度有限
- 把填充得到的基因型当作临床检测结果使用
需要准备的数据
- 芯片基因型
- PLINK 或 VCF 格式，已完成样本和位点质控；按染色体拆分、排序并 bgzip 压缩
- 参考面板
- 如 1000 Genomes、HRC 或 TOPMed；面板的基因组版本须与输入一致，或先做坐标转换
- 遗传图谱
- 定相和部分填充软件需要与基因组版本对应的遗传图谱文件，通常随软件提供
- 样本性别
- X 染色体需单独处理，男性非 PAR 区为单倍体，需要正确的性别信息
分析步骤
- 1
填充前质控
剔除检出率低和 HWE 严重偏离的位点、重复位点和单态位点。把位点与参考面板比对，检查等位基因是否匹配、链方向是否一致、频率差异是否过大，可用 HRC-1000G-check-bim 等脚本自动生成修正命令。
- 2
链方向与版本统一
按比对结果翻转反链位点，剔除无法判定方向的 A/T、C/G 回文位点（或按频率判断），确认 REF 等位基因与参考基因组一致。若芯片坐标为 GRCh37 而面板为 GRCh38，用 liftOver 等工具转换后再检查一遍。
- 3
相位推断
用 SHAPEIT、Eagle 或 Beagle 对每条染色体定相，样本量大时可以不依赖参考面板，样本量小时借助面板定相更准确。有家系数据时可利用亲子关系校正相位。
- 4
填充
用 Minimac4 或 Beagle 以定相结果为输入，对照参考面板填充；也可把整理好的 VCF 上传到在线填充服务，服务端会完成定相和填充。注意按染色体分块运行，并保留每个位点的质量指标。
- 5
质量评估
按 MAF 分组统计填充 R² 的分布，常见规律是低频位点 R² 明显更低。用已分型位点做留一法评估，比较填充值与真实基因型的一致性（Minimac 输出中的 EmpRsq 等列）。某条染色体整体偏低，常提示该染色体的链方向或版本出了问题。
- 6
过滤与格式转换
按 R² 或 INFO 阈值和 MAF 过滤，保留剂量（DS）或基因型概率（GP）字段，转换为 PLINK 2 的 pgen 或 BGEN 格式供下游使用。记录过滤前后的位点数，便于在方法部分报告。
关键参数与决策
参考面板选择
面板中与研究人群祖源相近的样本越多，填充越准确。欧洲人群常用 HRC 或 TOPMed，非洲和混合人群通常从 TOPMed 等多样化面板中获益更多。东亚人群可比较不同面板在已分型位点上的留一法表现后再选。
填充质量阈值
Minimac 的 Rsq、IMPUTE 的 INFO 和 Beagle 的 DR2 都近似表示填充剂量与真实基因型的相关平方。阈值越高越可靠但位点越少，关联分析常用 0.3，精细定位和 PRS 往往更严格。与 MAF 过滤同时设置。
剂量还是硬判型
关联分析应直接使用剂量，它保留了填充的不确定性，统计功效高于硬判型。需要离散基因型的分析（如部分单倍型和亲缘工具）才转换为硬判型，并可设置最低后验概率，如 0.9，低于阈值记为缺失。
定相是否依赖参考面板
样本量达到数千以上时，基于群体自身的定相已经很准确；样本量只有几百时，参考面板能显著改善相位。在线服务通常会自动选择，本地运行时需要自己决定并在方法中说明。
X 染色体处理
X 染色体的 PAR 区和非 PAR 区要分开处理，男性非 PAR 区按单倍体编码。性别信息错误会让男性杂合位点被当作分型错误，或导致填充质量整体偏低。
常见错误
- 填充前不检查链方向：反链位点会被当作另一种等位基因，局部单倍型匹配错误，填充 R² 普遍下降且效应方向可能颠倒。
- 芯片和参考面板的基因组版本不一致：位点无法匹配或被错配，部分染色体几乎没有可用位点，填充结果大面积缺失。
- 多个批次分别填充后直接合并：各批次通过 R² 阈值的位点不同，合并后缺失模式与批次相关，引入批次假阳性。
- 用硬判型代替剂量做关联：填充不确定的位点被强行归类，效应估计偏倚、检验效力下降。
- 只按 R² 过滤不看 MAF：R² 对极低频位点的估计本身不稳定，部分罕见位点 R² 偏高但实际填充很差。
- 未经审查就把个体数据上传到外部服务：可能违反伦理批件或数据使用协议，应先确认允许的数据处理方式。
结果怎么看
填充质量分布图
按 MAF 分箱展示 R² 的分布或均值，常见形态是常见位点 R² 高、低频位点逐渐下降。整体 R² 都低，提示参考面板与人群不匹配或输入质控存在问题；某个频率区间突然下降，可能是该区间的位点比对有误。
留一法一致性表
对已分型位点逐个屏蔽后再填充，比较填充值与真实值的相关或一致率。这是评估填充准确度最直接的证据。一致率明显低于同类研究，需要回头检查链方向、样本质控和面板选择。
频率比较散点图
横轴为参考面板同祖源的等位基因频率，纵轴为研究样本频率。点应集中在对角线附近；偏离对角线的位点可能是链翻转或错配，沿反对角线分布的成群位点通常是回文位点方向错误。
填充后位点汇总
列出各染色体填充前位点数、填充后位点数和通过过滤的位点数。各染色体保留比例应大体相近；某条染色体保留比例异常低，往往是该染色体的输入文件格式或坐标版本有问题。
和相近方法怎么选
在线填充服务与本地填充
在线服务省去软件安装和面板下载，部分面板只能通过服务使用。本地填充可控性更高，适合数据不允许外传或需要自定义面板的情况，但需要自行准备面板和计算资源。选择前先确认数据使用协议是否允许上传。
Minimac4 与 Beagle
两者都是广泛使用的填充工具。Minimac4 常与 Eagle 或 SHAPEIT 定相搭配，是多个在线服务的默认流程；Beagle 可在一次运行中完成定相和填充，使用方便。准确度上差异通常不大，按流程习惯和资源选择即可。
芯片填充与低深度测序填充
芯片填充输入的是确定的基因型，低深度测序输入的是带不确定性的基因型似然。后者需要 GLIMPSE 等专门方法，能更好地捕获低频变异，成本介于芯片和高深度测序之间。
常见问题
填充 R² 或 INFO 设多少合适？
没有统一标准。GWAS 中常用 0.3 保留尽量多的位点，再在结果中对显著位点逐一核查填充质量；精细定位、PRS 和需要高可靠基因型的分析常用 0.8 左右。阈值应与 MAF 过滤一起报告。
Michigan 和 TOPMed 填充服务怎么选？
两者都提供定相和填充，主要区别在可用的参考面板。TOPMed 面板样本量大、祖源多样，基于 GRCh38；Michigan 提供 1000 Genomes、HRC 等多个面板。按研究人群祖源和下游所需的基因组版本选择，并遵守各服务的数据使用条款。
填充前为什么要做相位推断？
填充算法把研究样本的每条单倍型与参考面板的单倍型做匹配，再根据匹配到的参考单倍型推断缺失位点。没有相位就无法确定哪些等位基因位于同一条染色体上。定相错误（切换错误）会直接降低填充准确度。
填充后的数据能做稀有变异分析吗？
要谨慎。大型多样化面板能较好地填充频率在千分之几以上的变异，更罕见的变异填充准确度明显下降。稀有变异分析最好使用测序数据；若使用填充数据，应采用严格的质量阈值并在验证集中确认。
X 染色体怎么填充？
X 染色体需单独准备输入，按 PAR 区和非 PAR 区分开处理，男性非 PAR 区编码为单倍体。多数在线服务支持 X 染色体，但对输入格式有专门要求。关联分析时也要按 X 染色体的剂量补偿模型编码男性基因型。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供芯片基因型文件并说明人群祖源和基因组版本，会先确认参考面板和质量阈值，然后完成填充前位点质控、链方向与版本统一、相位推断和基因型填充，再按 MAF 分组评估填充质量并按阈值过滤，转换为下游可用的剂量格式。交付填充后的基因型文件、质量分布图、频率比较图、位点汇总表、分析报告和可复现脚本。
我有 1500 例汉族 Illumina ASA 芯片数据（PLINK，GRCh37），想做定相和填充，过滤 R² 低于 0.3 的位点，输出能直接做 GWAS 的文件