GWAS 荟萃分析与跨祖源分析
单个队列的 GWAS 样本量有限，而复杂性状的单位点效应很小。荟萃分析把多个队列各自得到的汇总统计合并，不需要共享个体数据就能大幅提高样本量和检出能力，是大型遗传联盟的标准做法。最常用的工具是 METAL，它支持按标准误倒数加权的固定效应合并，以及在效应单位不一致时使用的样本量加权 Z 值合并。跨祖源荟萃分析合并来自欧洲、东亚、非洲等不同人群的结果：一方面增加样本量，另一方面利用各人群 LD 结构的差异，帮助后续精细定位。需要处理的主要问题是各队列之间的效应异质性，常用 Cochran Q、I² 评估，并在必要时使用随机效应模型或 MR-MEGA 等以祖源轴为协变量的荟萃回归。
什么时候用
- 有多个队列各自完成的 GWAS，想合并提高样本量
- 参加遗传联盟，需要按统一方案整合各成员的汇总统计
- 合并公开 GWAS 和自有队列结果，检验新位点并扩大发现
- 不同祖源人群都有同一性状的 GWAS，想做跨人群合并与异质性比较
- 为精细定位、PRS 或遗传相关分析准备更大样本量的汇总统计
不适合的情况
- 各队列表型定义差异很大（如自报与诊断混用却不分层）：合并后效应解释困难、异质性大
- 队列间存在大量未知样本重叠：会导致统计量膨胀，除非能估计并校正
- 只有一个队列却想用荟萃方法提高效力：应直接做单队列 GWAS
需要准备的数据
- 各队列汇总统计
- 需含 SNP、染色体、位置、效应与非效应等位基因、BETA、SE、P、效应等位基因频率、样本量和填充质量
- 队列信息表
- 每个队列的祖源、样本量（二分类需病例与对照数）、表型定义、协变量和使用的分析软件
- 参考频率
- 与各队列祖源匹配的公共参考频率，用于检查等位基因编码和链方向错误
- 主成分或祖源坐标（跨祖源）
- MR-MEGA 等方法需要基于各队列等位基因频率计算的祖源轴，通常由软件从汇总统计中计算
分析步骤
- 1
制定分析方案
在合并前统一各队列的表型定义、协变量、表型变换、填充面板和输出格式，形成分析计划。方案不统一是荟萃异质性的主要来源，事后很难完全补救。
- 2
逐队列质控
对每份汇总统计检查列格式、缺失值、P 值与 BETA/SE 是否一致（P-Z 图）、标准误与样本量是否匹配（SE-N 图），以及效应等位基因频率与参考频率的散点图，可用 EasyQC 等工具批量完成。异常队列先与提供方核实。
- 3
统一位点与等位基因
统一基因组版本和位点 ID，按效应等位基因对齐，翻转反链位点，处理回文位点，并按 INFO 和 MAF 过滤。保留各队列每个位点的样本量，便于后续计算有效样本量。
- 4
固定效应荟萃
在 METAL 中用 SCHEME STDERR 按标准误倒数加权合并 BETA，或在效应尺度不统一时用 SCHEME SAMPLESIZE 合并 Z 值；同时开启 ANALYZE HETEROGENEITY 输出 Q 检验和 I²。检查合并后 QQ 图和 λGC。
- 5
异质性与跨祖源分析
对显著位点检查各队列效应方向和 I²。跨祖源时可用随机效应模型或 MR-MEGA，把祖源相关的异质性与其他异质性分开。比较各祖源组内的效应大小，判断信号是否在人群间共享。
- 6
整理信号与输出
按全基因组显著阈值筛选位点，用 LD 参考 clump 或条件分析得到独立信号；跨祖源结果的 LD 参考需谨慎选择。输出标准化的荟萃汇总统计、各位点的队列数和总样本量。
关键参数与决策
标准误加权还是样本量加权
各队列效应单位一致（同一表型变换、同一模型）时用标准误加权，能得到合并的效应值。表型单位不一致或部分队列只提供 P 值和方向时，用样本量加权的 Z 值合并，但只得到 Z 值和 P 值。
有效样本量
二分类表型用 4/(1/病例数 + 1/对照数) 计算各队列有效样本量，样本量加权和下游 LDSC 都应使用它。病例对照比例差别大的队列，直接用总样本量会高估其权重。
基因组控制
METAL 的 GENOMICCONTROL ON 会用各队列的 λGC 校正统计量。大样本多基因性状的 λGC 偏高主要来自真实信号，过度校正会损失检出力，越来越多研究改用 LDSC 截距评估膨胀，并在方法中说明选择。
位点纳入条件
常见做法是只保留出现在多个队列、或合计样本量达到总样本量一定比例的位点。只在一个小队列出现的位点合并后与单队列结果无异，却会被当作荟萃结果报告。
固定效应还是随机效应
固定效应假设各队列真实效应相同，检出力高，是发现阶段的常规选择。异质性明显时，随机效应估计更保守，但在队列数少时方差估计不稳。跨祖源时荟萃回归能解释部分异质性来源。
常见错误
- 队列之间效应等位基因方向不统一：合并时效应相互抵消，真实信号变弱，Q 检验同时异常显著。
- 忽略队列间样本重叠：同一批对照被多个队列共用时统计量被高估，LDSC 交叉截距可以帮助发现这一问题。
- 某个队列标准误被低估：如使用了错误的模型或未校正亲缘，该队列在加权中占比过大，合并结果被其主导。
- 对已大量膨胀的队列不做处理就合并：一个有分层问题的队列会让荟萃结果整体出现假阳性峰。
- 跨祖源荟萃后用单一祖源 LD 做 clump 或精细定位：LD 不匹配会错误合并或拆分信号。
- 只报告合并 P 值不给方向与异质性：读者无法判断信号是否由单一队列驱动。
结果怎么看
合并曼哈顿图与 QQ 图
与单队列 GWAS 解读方式相同，但更关注新出现的位点和 λGC。λGC 远高于各单队列，可能是样本重叠或某队列质控问题；可同时报告 LDSC 截距判断膨胀来源。
队列质控散点图
包括各队列效应等位基因频率与参考频率散点图、P-Z 图和 SE-N 图。频率图上成片位点沿反对角线，说明等位基因编码反了；SE-N 图中某队列偏离整体趋势，提示其样本量或标准误报告有误。
显著位点森林图
对每个独立显著位点列出各队列的效应值和置信区间，以及合并效应。效应方向一致、置信区间重叠说明信号稳健；只有一个队列显著而其他接近零，需检查该队列在该位点的质量。
异质性与跨祖源结果表
列出每个显著位点的 Q 检验 P 值、I²、各祖源组效应和 MR-MEGA 中的祖源相关异质性。I² 高但方向一致，常是效应大小不同；方向相反则需要考虑表型定义或位点质量问题。
和相近方法怎么选
汇总统计荟萃与个体数据合并分析
个体数据合并可以统一质控和模型，但需要数据共享，常受伦理和协议限制。汇总统计荟萃在固定效应假设下与合并分析效力相近，且隐私风险低，是多队列合作的主流方式。可共享个体数据时，两者可互相验证。
METAL 与随机效应工具
METAL 速度快、使用广泛，提供固定效应合并和异质性统计。需要随机效应或修正的随机效应模型时，可用 METASOFT 等工具；GWAMA 也支持两类模型。发现阶段常用固定效应，对显著位点再做随机效应敏感性分析。
跨祖源固定效应与 MR-MEGA
跨祖源固定效应荟萃简单，但若效应在人群间不同会损失检出力。MR-MEGA 用由等位基因频率得到的祖源轴作为协变量做荟萃回归，能把祖源相关异质性分离出来，适合队列数较多、祖源多样的研究。
常见问题
METAL 的 STDERR 和 SAMPLESIZE 方案怎么选？
各队列表型单位和模型一致、能提供可比的 BETA 和 SE 时选 STDERR，可得到合并效应值。表型尺度不同或只有 P 值与方向时选 SAMPLESIZE，结果只有 Z 值和 P 值。两种方案的 P 值在大多数情况下相近，可互为检验。
I² 多大说明异质性高？
通常以 25%、50%、75% 作为低、中、高异质性的经验分界。GWAS 中单个位点的 I² 受队列数和样本量影响较大，队列很少时估计不稳定。应结合 Q 检验 P 值和森林图一起判断，而不是只看一个数字。
队列之间有样本重叠怎么办？
最好在合并前剔除重叠样本或让各队列互斥。无法剔除时，可以用 LDSC 交叉截距估计重叠带来的统计量相关，并在荟萃中校正；部分方法允许输入相关矩阵。至少要在方法中说明可能的重叠及其影响。
跨祖源荟萃有什么额外好处？
除了增加样本量，不同人群 LD 长度和结构不同，合并后可以缩小精细定位的可信变异集，并检验信号在人群间是否共享。它也能发现在某些祖源中频率较高、在欧洲人群中罕见的变异。
荟萃后需要再做基因组控制吗？
看情况。若各队列已经做过校正，再在合并结果上做一次会双重校正、降低检出力。大样本多基因性状建议用 LDSC 截距判断膨胀来源，截距接近 1 时通常不需要额外校正。具体选择要在方法部分写明。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供多个队列的 GWAS 汇总统计和队列信息表，会先确认合并方案、加权方式和异质性分析方法，然后逐队列做格式与频率质控，统一基因组版本和效应等位基因，运行固定效应荟萃和异质性检验，跨祖源时补充分祖源比较与荟萃回归。交付合并曼哈顿图与 QQ 图、队列质控图、显著位点森林图、异质性结果表、标准化荟萃汇总统计、分析报告和可复现脚本。
我有 4 个队列（2 个欧洲、2 个东亚）的骨密度 GWAS 汇总统计，想用 METAL 做荟萃分析并评估跨人群异质性，输出显著位点的森林图