罕见病基因组分析：三联体与 HPO 表型排序
罕见病大多是单基因病，一个患者的外显子组里通常有数万个变异，真正致病的往往只有一两个。罕见病基因组分析的任务就是把这些变异缩减到少数几个候选：一方面利用家系信息，最常见的是患者加父母的三联体，按新发、隐性纯合、复合杂合、X 连锁等遗传模式过滤；另一方面利用患者表型，用人类表型本体 HPO 的标准术语描述临床特征，再计算候选基因已知疾病表型与患者的相似度进行排序。Exomiser、LIRICAL 等工具把变异致病性、人群频率和表型匹配综合成一个排名。典型数据是三联体 WES 或 WGS 的联合分型 VCF、家系 PED 文件和 HPO 术语列表。本页属于科研分析方法介绍，结果需由有资质的临床遗传团队复核，不替代临床诊断。
什么时候用
- 先证者和父母三联体 WES 或 WGS，寻找新发或隐性致病变异
- 近亲婚配家系，结合纯合区段定位隐性致病基因
- 多个受累成员的大家系，筛选与疾病共分离的变异
- 首次分析阴性的病例，按最新数据库和表型重新分析
- 研究队列中聚合多个家庭，寻找同一基因上的反复变异，提出新的疾病基因
不适合的情况
- 多基因复杂疾病的风险评估，应使用 GWAS 或多基因风险评分
- 体细胞嵌合比例很低的变异，常规深度的 WES 难以检出
- 只做单个变异的致病性定级，应参照 ACMG 分类流程
需要准备的数据
- 家系联合分型 VCF
- 三联体或家系成员一起做联合分型，保留每个人的基因型、深度和基因型质量，避免分别调用后合并造成缺失
- PED 家系文件
- 六列：家系 ID、个体 ID、父亲 ID、母亲 ID、性别、是否患病，个体 ID 必须与 VCF 样本名完全一致
- HPO 表型术语
- 用 HP: 开头的标准 ID 描述患者特征，尽量具体到细分术语，并记录明确不存在的重要表型
- 补充变异结果
- CNV、结构变异、线粒体和重复扩增检测结果，单核苷酸流程看不到这些变异类型
分析步骤
- 1
家系质控
用 peddy 或 somalier 等工具核对亲缘关系和性别，确认父母与先证者确实为亲子关系；计算孟德尔错误率，异常偏高通常提示样本混淆或分型质量差，必须先解决再往下分析。
- 2
变异注释
为每个变异注释基因与转录本后果、gnomAD 等人群频率、ClinVar 记录、错义致病性分数和 SpliceAI 等剪接预测。统一使用 MANE 等标准转录本，避免同一变异在不同转录本上后果不一。
- 3
遗传模式过滤
分别筛选：父母均无而先证者有的新发变异；隐性纯合；同一基因上分别来自父亲和母亲的两个杂合变异，即复合杂合；男性患者 X 染色体半合子变异。slivar 等工具可按 PED 自动完成。
- 4
频率与质量过滤
按遗传模式设置不同频率上限，显性和新发通常要求在人群中极罕见，隐性可适当放宽。新发候选要检查父母该位点深度是否足够，避免把父母漏检的杂合当作新发。
- 5
整理 HPO 表型
把病历中的临床描述转换为 HPO 术语，优先用具体的子术语而不是宽泛的上层术语。表型列表质量直接决定排序效果，一般选择最有特征性的若干项。
- 6
表型驱动排序
用 Exomiser 或 LIRICAL 把变异评分、频率和表型相似度合并，输出基因或疾病排名。查看排名前列的候选，检查其已知疾病的遗传方式是否与家系模式一致。
- 7
候选复核与验证
在 IGV 中查看候选变异的 reads 支持，查阅文献与 OMIM 确认基因-疾病关系，按 ACMG 标准定级。最终候选需要 Sanger 测序验证和家系共分离分析。
- 8
阴性病例补充
排序无果时，加查 CNV、结构变异、线粒体变异、重复扩增和深部内含子剪接变异，考虑亲本嵌合；之后可随数据库和新疾病基因的更新定期重新分析。
关键参数与决策
人群频率上限
显性和新发变异常用远低于隐性的上限，经验上隐性可放宽到约 1%，显性要求更严格。具体值应结合疾病患病率和外显率估算，并考虑患者族群在参考数据库中的代表性。
新发变异判定
要求先证者杂合且等位基因比例合理，父母在该位点深度足够且没有 alt reads。父母深度不足时只能视为可能新发；亲本低比例嵌合也可能被误判为新发。
复合杂合定相
两个杂合变异必须分别来自父母、位于不同染色体拷贝上才构成复合杂合。没有父母数据时无法确定顺式或反式，可用 reads 定相或长读长测序辅助判断。
HPO 术语选择
术语越具体，表型相似度区分力越强；输入过多不相关或常见的表型会稀释信号。可以分别用核心表型和完整表型各跑一次，比较排名的稳定性。
排序工具的预设模式
Exomiser 需指定要考虑的遗传模式和频率来源。不确定遗传方式时应开放多种模式，否则真正的致病变异可能在过滤阶段就被排除。
常见错误
- 家系分别调用变异再合并：某人未检出的位点会被当作参考型，造成大量假新发变异，应使用 gVCF 联合分型。
- 跳过亲缘关系核查：非亲生或样本错配会让新发和遗传模式判断全部失效，得到看似合理却完全错误的候选。
- 频率过滤过严：在特定族群中相对常见的隐性致病变异，或外显率不完全的显性变异，可能被统一阈值直接过滤掉。
- HPO 只填「智力障碍」等宽泛术语：大量基因都匹配这类表型，排序几乎失去区分力，应补充特异性体征和影像特征。
- 只看 SNV 和小插入缺失：外显子级缺失、重复扩增和线粒体变异都是常见病因，标准流程看不到它们，会导致假阴性。
- 忽视基因-疾病关系强度：候选基因与表型仅有个案报道支持时，不能当作确定结论，应注明证据等级。
结果怎么看
家系质控报告
包括亲缘系数、推断性别、孟德尔错误率和测序覆盖度。父母与先证者的亲缘系数应接近 0.5，性别与记录一致；任何一项不符都应先排查样本。
遗传模式候选表
按新发、纯合、复合杂合、X 连锁分类列出候选变异，附频率、致病性预测和各成员基因型。新发候选通常只有个位数，过多提示分型或质控问题。
表型排序结果
Exomiser 等输出的基因排名和综合分，以及匹配上的疾病和表型。看前几名是否在遗传方式和表型上同时吻合；排名靠前但遗传方式不符的基因应降级。
候选变异证据汇总
每个重点候选的 reads 截图、文献和数据库证据、ACMG 定级与验证建议。证据链中任何一环缺失，都应标为待验证而不是阳性结论。
和相近方法怎么选
三联体与单人先证者分析
三联体可直接识别新发变异并为复合杂合定相，候选数量通常大幅减少；单人分析只能依赖频率和预测，候选更多，遗传方式也难确定。预算有限时可先单人分析，阴性后补充父母样本。
Exomiser 与 LIRICAL
Exomiser 综合变异分、频率和多种来源的表型相似度给出基因排名；LIRICAL 用似然比框架计算每个疾病的后验概率，结果更便于解释证据来源。两者可同时运行，相互印证。
WES 与 WGS 用于罕见病
WES 成本低，覆盖大部分已知致病变异；WGS 覆盖更均匀，还能检测深部内含子变异、结构变异和重复扩增，对 WES 阴性病例更有价值，但数据量和解读工作量更大。
罕见病基因组分析与 ACMG 变异分类
本流程从全部变异中找出候选基因和变异，回答哪个最可能致病；ACMG 分类针对已选出的单个变异给出致病性等级。前者是筛选与排序，后者是逐个定级，通常前后衔接。
常见问题
罕见病 WES 一般怎么筛选变异？
常规顺序是质控、注释、按人群频率过滤常见变异、保留可能影响蛋白的变异，再按家系遗传模式筛选，最后结合 HPO 表型排序。每一步保留中间结果，便于回溯被过滤掉的变异。
HPO 术语怎么获取和填写？
可以在 HPO 官网按关键词检索临床特征，得到 HP: 开头的标准 ID。填写时选最具体的术语，例如具体的癫痫类型而不是笼统的「癫痫发作」，并保留典型的阴性表型供部分工具使用。
什么是复合杂合变异？
同一基因上的两个不同杂合变异，分别位于父源和母源两条染色体上，使两个拷贝都失去功能，属于常染色体隐性遗传。如果两个变异来自同一亲本，则位于同一条染色体上，不构成复合杂合。
三联体分析为什么容易找到新发变异？
因为可以直接比较父母和孩子的基因型，只在孩子中出现而父母都没有的变异就是新发候选。新发变异在每个人身上数量很少，经过质量过滤后通常只剩少数几个，大大缩小了范围。
WES 结果阴性下一步怎么办？
可检查 CNV、线粒体和重复扩增，必要时升级到 WGS 或长读长测序；补充或细化 HPO 表型；考虑亲本嵌合和非经典遗传方式；间隔一段时间用更新的数据库和疾病基因列表重新分析。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供家系 VCF、PED 文件和 HPO 术语或临床描述。Codar 确认方案后先做家系关系和质量核查，再按新发、隐性、复合杂合和 X 连锁等模式筛选变异，把临床描述整理为 HPO 术语并计算候选基因与已知疾病的表型匹配度，综合排序候选。交付质控报告、遗传模式候选表、表型排序结果、候选证据报告和可复现脚本。
我有一个三联体 WES 联合分型 VCF 和 PED 文件，孩子有发育迟缓、癫痫和小头畸形，帮我找新发和隐性候选并按 HPO 表型排序