线粒体 DNA 变异与异质性分析
线粒体 DNA（mtDNA）是一条约 16.6 kb 的环状基因组，每个细胞中有成百上千个拷贝，母系遗传，不发生常规重组。同一个体内可能同时存在突变型和野生型 mtDNA，这种状态称为异质性（heteroplasmy），突变型所占比例称为异质性水平；所有拷贝都相同则为同质性（homoplasmy）。线粒体变异分析要回答三个问题：有哪些变异、每个变异的异质性比例是多少、个体属于哪个单倍群。数据可来自 mtDNA 长片段扩增测序，也可从 WGS、WES 中提取线粒体读段。分析的难点在于环状基因组的比对、核基因组中线粒体同源片段（NUMT）的干扰和低比例变异的真假区分。本页内容属于科研分析，不能替代临床诊断。
什么时候用
- 研究线粒体病相关位点，在患者及家系中定量异质性水平
- 利用已有 WGS、WES 数据顺带获得 mtDNA 变异和单倍群
- 人群或进化研究中做母系单倍群分型与系统发育
- 肿瘤与正常组织对比，寻找体细胞 mtDNA 突变
- 估计组织或血液中的 mtDNA 拷贝数，研究其与衰老或疾病的关系
- 单细胞数据中利用 mtDNA 变异追踪细胞克隆关系
不适合的情况
- 用常规二倍体胚系变异检测参数分析 mtDNA：会把异质性变异强制判为杂合或丢弃
- 测序深度很低时报告低于数个百分点的异质性：误差背景下无法与真实信号区分
- 仅凭单个样本的低频变异下结论：需要重复样本或独立方法验证
需要准备的数据
- 测序比对文件
- WGS、WES 或 mtDNA 扩增测序的 BAM 或 FASTQ；WES 中线粒体读段多来自脱靶捕获，深度波动较大。
- 参考序列
- 建议用 rCRS，GRCh38 的 chrM 即为 rCRS；UCSC hg19 的 chrM 不是 rCRS，位置会错开。
- 样本与家系信息
- 组织类型、是否为母系亲属、肿瘤与配对正常样本，用于判断变异来源和组织间异质性差异。
- 已知位点数据库
- MITOMAP、HmtVar、gnomAD 线粒体变异频率等，用于注释致病性报道和人群频率。
分析步骤
- 1
提取线粒体读段
从全基因组比对结果中提取比对到 chrM 的读段，或直接使用 mtDNA 专项测序数据。统计 chrM 平均深度和覆盖均一性，深度直接决定能可靠检测的最低异质性水平。
- 2
重新比对处理环状结构
环状基因组在序列首尾断点处（位于控制区）比对不完整。GATK 线粒体流程会同时比对到标准参考和平移后的参考，再合并两套结果，使控制区变异也能被正确检出。
- 3
变异检测
使用 Mutect2 的线粒体模式（--mitochondria-mode）等支持任意等位基因比例的工具，报告每个位点的变异等位基因比例。不要使用按二倍体基因型输出的胚系检测模式。
- 4
过滤假阳性
按深度、链偏好、碱基质量和读段位置过滤，并用 NUMT 相关的过滤策略剔除低比例的核来源信号。同一批次多个无关样本在同一位置出现相近的低比例信号，多为系统误差。
- 5
单倍群分型
用 HaploGrep 等工具基于同质性变异确定单倍群，并检查与预期标志位点是否一致。单倍群定义位点缺失或出现冲突时，可能存在样本污染或混样。
- 6
注释与解读
将变异注释到基因、tRNA、rRNA 和控制区，结合 MITOMAP 已报道的致病位点、人群频率和异质性水平解读。同一变异在不同组织中的异质性可能差异很大，解读时要注明样本组织。
- 7
拷贝数估计
用线粒体平均深度与常染色体平均深度之比估计每个细胞的 mtDNA 拷贝数。WGS 数据结果较可靠，WES 和靶向数据受捕获效率影响，不宜直接用于拷贝数估计。
关键参数与决策
异质性检测下限
常见研究报告阈值在 1% 到 5% 之间，取决于深度、测序误差率和是否有重复样本，这是经验范围。深度数千以上时可下探到更低比例，一般 WGS 深度下低于数个百分点的结果要谨慎。
参考序列版本
使用 rCRS 坐标可以直接与 MITOMAP 和 HaploGrep 对应；若数据比对到 hg19 的 chrM，位置与命名都会偏移，应重新比对到 rCRS 后再分析。
NUMT 处理策略
核基因组中存在大量与 mtDNA 高度相似的片段。比对到完整基因组而非只比对到 chrM，可以让 NUMT 读段优先落到核位置；mtDNA 拷贝数越低，NUMT 造成的假异质性越明显。
比对与碱基质量阈值
提高最低碱基质量和比对质量可以降低低频假阳性，但会损失深度。低频异质性分析通常需要较严格的阈值，同质性变异与单倍群分型可适当放宽。
体细胞与胚系区分
肿瘤研究中需要配对正常组织，在两者中均存在的变异多为胚系或母系遗传，只在肿瘤中出现或异质性显著变化的才考虑为体细胞突变。
常见错误
- 用二倍体基因型检测工具分析 mtDNA：异质性比例被压缩为 0、0.5、1 三档，低比例变异直接丢失。
- 只比对到 chrM 序列：NUMT 来源的读段被迫落到线粒体上，形成大量 1% 到 10% 的假异质性位点。
- 忽略环状基因组首尾断点：控制区起止附近覆盖骤降，位于该区域的常见变异被漏检。
- 坐标系统混用：hg19 chrM 与 rCRS 位置不同，直接查询 MITOMAP 会对错位点，导致致病位点判断错误。
- 把血液中的异质性水平当作所有组织的水平：部分致病变异在血液中随年龄下降，与肌肉、尿沉渣细胞差异明显。
- 忽视样本污染：混入他人 DNA 时出现多个单倍群标志位点的中等比例信号，被误读为多处异质性。
结果怎么看
mtDNA 覆盖深度图
沿 16.6 kb 环状基因组展示每个位置的深度。深度应较为均匀；某段深度骤降可能是大片段缺失、扩增失败或比对困难区，大片段缺失需结合断点读段确认。
变异与异质性表
每行一个变异，列出位置、碱基变化、所在基因、异质性比例、深度和过滤状态。异质性接近 100% 为同质性；中低比例变异需要查看链偏好和是否为已知 NUMT 易混位点。
单倍群结果
给出单倍群名称、匹配质量和缺失或额外的标志位点。质量分数低或缺少多个标志位点，提示覆盖不足、污染或比对问题，应先排查再用于群体分析。
异质性分布图
多个样本或组织中同一变异的异质性比例对比。家系中母亲与子代比例差异大是线粒体瓶颈效应的常见表现；肿瘤与正常组织之间比例显著变化提示体细胞事件。
mtDNA 拷贝数表
列出各样本线粒体深度、常染色体深度和估计拷贝数。同一组织类型样本间差异过大，可能来自建库批次或 DNA 提取方法差异，需在比较前校正。
和相近方法怎么选
线粒体变异检测与核基因组胚系变异检测
核基因组按二倍体模型输出纯合或杂合基因型；mtDNA 是多拷贝、母系遗传，需要按连续的等位基因比例报告异质性，并处理环状结构和 NUMT。两类分析可以来自同一份 WGS，但应使用不同工具和参数。
mtDNA 专项测序与从 WGS 提取
长片段扩增测序深度高，能检测更低比例的异质性，但扩增可能带来偏好和嵌合；WGS 中线粒体读段深度通常已足够做单倍群和中高比例异质性，还能同时估计拷贝数。研究低比例异质性选专项测序，大队列筛查用 WGS。
Mutect2 线粒体模式与专用工具
Mutect2 线粒体模式是 GATK 线粒体流程的核心，适合与已有 GATK 流程衔接；mtDNA-Server、MToolBox 等专用工具把比对、检测、单倍群和注释打包。按现有流程和是否需要单倍群一体化结果选择。
常见问题
线粒体异质性是什么意思？
指同一个体或组织中同时存在两种或多种不同序列的 mtDNA，突变型所占比例称为异质性水平。很多线粒体致病变异存在阈值效应，异质性超过一定比例时才出现明显功能缺陷，不同组织阈值也不同。
WES 数据可以分析线粒体变异吗？
可以尝试。很多捕获试剂并不专门捕获 mtDNA，但由于线粒体拷贝数高，脱靶读段往往能提供一定深度。深度不均匀时控制区或部分基因可能覆盖不足，适合做同质性变异和单倍群，低比例异质性结果要谨慎。
什么是 NUMT，为什么会造成假阳性？
NUMT 是插入到核基因组中的线粒体来源片段，与 mtDNA 序列高度相似但积累了自己的突变。如果这些读段被比对到线粒体上，会在多个位置表现为低比例变异，看起来像异质性，因此需要专门过滤。
线粒体单倍群怎么确定？
将样本的同质性变异与线粒体系统发育树中各分支的标志位点比对，常用工具是 HaploGrep。它会给出最匹配的单倍群和匹配质量，标志位点大量缺失或出现多个分支的混合信号时，需要检查覆盖和污染。
m.3243A>G 这类位点检测出来能直接判断疾病吗？
不能。这类位点虽是已报道的经典致病变异，但临床表现与异质性水平、受累组织和个体差异密切相关，血液异质性也可能低于肌肉。科研分析结果需由临床遗传专业人员结合表型和其他检查综合判断。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 WGS、WES 或 mtDNA 测序数据并说明样本来源后，会先确认分析方案，然后提取并比对线粒体读段，检测变异并计算异质性水平，过滤 NUMT 和测序误差带来的低频假信号，并对变异做注释。交付变异与异质性表、覆盖深度图、样本间异质性比较图、分析报告和可复现脚本。
我有一个线粒体病家系 5 个人的 WGS BAM，想检测 mtDNA 变异和异质性比例，看 m.3243A>G 在每个人中的比例