非靶向代谢组分析与 OPLS-DA
非靶向代谢组学用液相色谱-质谱（LC-MS）或气相色谱-质谱（GC-MS）尽可能多地检测样本中的小分子，不预先限定目标化合物，用来发现组间差异代谢物和受影响的代谢通路。数据处理的难点在于：原始数据只是成千上万个由质荷比（m/z）和保留时间定义的特征峰，同一代谢物会产生多个加合物和同位素峰，而且多数特征无法确证结构。分析通常包括峰提取与对齐、特征过滤、标准化、PCA 与 OPLS-DA 等多变量统计、单变量检验、代谢物注释和通路富集。典型样本是血清、血浆、尿液、组织和细胞提取物。
什么时候用
- 疾病组与对照组比较，寻找差异代谢物和候选标志物
- 药物处理或基因敲除后，评估代谢通路的整体变化
- 饮食或菌群干预研究中，观察宿主血清或粪便代谢变化
- 与转录组、蛋白组整合，确认代谢酶变化是否体现在代谢物水平
- 事先不清楚哪些代谢物会变化，需要无偏筛查后再做靶向验证
不适合的情况
- 需要准确浓度的研究：应使用带内标和标准曲线的靶向代谢组
- 没有混合 QC 样本且跨多批上机的数据：难以可靠校正信号漂移
- 只凭 OPLS-DA 能分开两组就宣称找到诊断标志物：需独立样本验证
需要准备的数据
- 原始质谱数据
- 各厂商原始格式或 mzML（可用 ProteoWizard msconvert 转换），正负离子模式分开存放
- 样本信息表
- 样本名、分组、上机顺序、批次，并标记 QC、空白和标准品样本
- 混合 QC 样本
- 由全部样本等量混合而成，在序列开头用于平衡色谱柱，并在样本间定期穿插进样
- 二级谱图
- DDA 或 DIA 方式采集的 MS/MS 谱图，用于谱库匹配；只有一级数据时注释可信度有限
分析步骤
- 1
峰提取与对齐
用 MS-DIAL、XCMS 或 MZmine 做峰检测、保留时间校正、跨样本对齐和缺失峰回填，得到特征 × 样本强度表，正负离子模式各处理一次。用内标或已知代谢物检查峰形和对齐是否合理。
- 2
过滤与质控
扣除在空白中也有较高信号的特征，去除在多数样本中缺失的特征；利用 QC 样本校正信号漂移，并剔除在 QC 中波动过大的特征。校正方法和阈值的细节见代谢组质控与批次校正页。
- 3
标准化与缩放
按总峰面积、PQN 或样本重量、体积、蛋白含量标准化，再做 log 转换。多变量分析前常用 Pareto 缩放，在不过度放大噪声的前提下削弱高丰度特征的主导作用。
- 4
PCA 无监督检查
PCA 得分图中 QC 样本应紧密聚在一起，说明仪器状态稳定；样本组若有分离趋势，说明组间差异较强。远离所有样本的离群点，先查提取和进样记录再决定取舍。
- 5
OPLS-DA 建模
用 R 包 ropls 或 SIMCA 等软件建立两组 OPLS-DA 模型，查看 R2Y 和 Q2，并做置换检验评估是否过拟合。提取每个特征的 VIP 值，用于后续筛选。
- 6
筛选差异特征
对每个特征做 t 检验或 Wilcoxon 检验并进行 FDR 校正，计算倍数变化，与 VIP 联合筛选。合并同一代谢物的不同加合物和同位素峰，避免一个化合物被重复计入。
- 7
鉴定与通路分析
用精确质量、同位素分布和 MS/MS 谱图匹配 HMDB、MassBank、MoNA 等数据库并标注鉴定等级。对已注释的差异代谢物在 MetaboAnalyst 等工具中做通路富集和拓扑分析。
关键参数与决策
缩放方式
Pareto 缩放（除以标准差的平方根）是代谢组多变量分析的常用选择；单位方差缩放让所有特征权重相同，但会放大低强度噪声；不缩放时少数高丰度代谢物会主导模型。
VIP 阈值
常用 VIP > 1 作为经验阈值，并与单变量检验的 P 值或 FDR、倍数变化共同使用。VIP 只反映特征对分组模型的贡献，本身不是显著性检验，不能单独作为筛选依据。
置换检验次数
常做 200 次左右置换（经验值）。置换模型的 Q2 应明显低于原模型，Q2 回归线在纵轴上的截距为负或接近 0 时，通常认为没有明显过拟合。
加合物与离子模式
正模式常见 [M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+，负模式常见 [M-H]-、[M+FA-H]-。注释时按样本基质和流动相设定可能的加合物类型，设得过宽会增加错误匹配。
单变量检验与校正
数据近似正态时用 t 检验，否则用 Wilcoxon 检验；多组用 ANOVA 或 Kruskal-Wallis。特征数常上千，P 值需做 BH 校正，样本量很小时可报告未校正 P 值但需注明。
常见错误
- 只展示 OPLS-DA 得分图分得开：变量数远多于样本数时，有监督模型几乎总能把两组分开，必须同时给出置换检验和 Q2。
- 把每个特征当作一个代谢物：同一化合物的多个加合物、同位素峰和源内碎片会形成多个特征，不合并会重复计数并夸大通路富集。
- 把一级精确质量匹配当作确证鉴定：同分异构体的质量相同，仅凭 m/z 只能算推测注释，关键代谢物需要标准品确认。
- 样本按组别顺序上机：信号漂移与分组完全混杂，后期校正也难以分离，上机顺序应随机化并定期穿插 QC。
- 通路富集以全部 KEGG 化合物为背景：实际检测范围只覆盖其中一小部分，应以本实验检测并注释到的代谢物作为背景。
- 尿液样本不校正稀释度：尿液浓度随饮水量大幅波动，不按肌酐、渗透压或 PQN 校正时，差异主要反映稀释程度。
结果怎么看
PCA 得分图
QC 样本应聚成紧密的一团；若 QC 沿上机顺序呈轨迹状分布，说明漂移校正不充分。样本组的分离程度反映无监督条件下的整体差异强弱。
OPLS-DA 得分图与置换检验图
得分图看预测成分方向上两组是否分开。置换检验图中，置换模型的 R2 和 Q2 应低于最右侧原模型，Q2 回归线截距为负较理想；只有得分图而无置换结果的模型可信度不足。
S-plot 与 VIP 图
S-plot 两端远离原点的点，对分组贡献大且相关性高，是候选差异代谢物；VIP 排序图列出贡献最大的特征，需要结合注释等级判断其能否给出生物学解释。
差异代谢物表
列出 m/z、保留时间、注释名称、鉴定等级、加合物类型、VIP、P 值、FDR 和倍数变化。注释名相同的多行，可能来自正负模式或不同加合物，需要去重。
通路富集气泡图
常以通路影响值（拓扑分析）为横轴、-log10(P) 为纵轴。某条通路只命中一两个代谢物时，即使 P 值较小，结论也应保守。
和相近方法怎么选
PCA、PLS-DA 与 OPLS-DA
PCA 无监督，用于质控和观察整体结构；PLS-DA 利用分组信息寻找区分方向；OPLS-DA 把与分组无关的变异分到正交成分，预测能力与 PLS-DA 相近，但得分图和 S-plot 更易解释。后两者都需要验证以防过拟合。
非靶向与靶向代谢组
非靶向覆盖面广，可以发现新线索，但只有相对定量且注释不确定；靶向代谢组用标准品和内标对预设代谢物定量，准确度高、覆盖面窄。常见路线是非靶向筛选、靶向验证。
LC-MS 与 GC-MS
LC-MS 适合极性范围较宽的代谢物和脂质，不需要衍生化；GC-MS 适合挥发性或衍生化后的小分子，如有机酸、糖和氨基酸，电子轰击谱图标准化程度高，可用 NIST 等谱库匹配。
常见问题
VIP 大于 1 就是差异代谢物吗？
不是。VIP 衡量变量对 OPLS-DA 模型的贡献，没有显著性含义。通常要求 VIP > 1，同时单变量检验的 P 值（最好经 FDR 校正）小于 0.05，并参考倍数变化，几项同时满足才列为差异代谢物。
OPLS-DA 的 Q2 多少算好？
没有统一标准。Q2 越接近 1 预测能力越强，经验上 Q2 > 0.5 被视为较好，复杂的生物样本中较低的值也常见。更关键的是置换检验显示原模型明显优于随机模型，单看 Q2 无法判断是否过拟合。
代谢物鉴定等级是什么意思？
代谢组学标准倡议（MSI）将鉴定分为四级：一级是用标准品在相同条件下确证；二级是基于谱库匹配的推测注释；三级只能推断到化合物类别；四级为未知物。非靶向结果大多处于二、三级。
正负离子模式的数据怎么合并？
两种模式各自完成峰提取、过滤和校正后再合并特征表。同一代谢物在两种模式下都被检出时，保留峰形和重复性更好的一条，避免在差异统计和通路分析中重复计数。
没有二级谱图还能做通路分析吗？
可以用 mummichog 等方法，直接基于一级 m/z 列表推断通路活性，不需要先确证代谢物身份，MetaboAnalyst 中提供相应模块。这类结果是推测性的，关键通路需要靶向方法验证。
在 Codar 里怎么做
Codar 先确认分组、离子模式、QC 样本和筛选阈值，再运行非靶向代谢组分析完成峰提取、对齐、过滤与标准化；随后做 PCA、OPLS-DA 与置换检验及单变量统计，筛选差异代谢物；对其做鉴定与注释并标注等级，最后做通路富集。交付特征表、多变量统计图、差异代谢物表、通路图和可复现脚本。
我有 40 例血清的 LC-MS 非靶向数据，正负离子模式都有，含 QC 样本，比较糖尿病肾病和单纯糖尿病，做 OPLS-DA 并筛差异代谢物