代谢组质控、归一化与批次校正
质谱代谢组在长时间进样中，离子源逐渐污染、色谱柱状态变化，会让同一个代谢物的信号随进样顺序缓慢下降或波动；样本分多批上机时，批与批之间还会出现整体跳变。这些技术变异往往比生物学差异还大。代谢组质控与批次校正就是在统计分析之前，利用反复进样的混合 QC 样本估计并去除这种漂移，再过滤不稳定的特征、处理缺失值、校正样本间的总量差异，得到可以直接比较的数据矩阵。它适用于非靶向和靶向 LC-MS、GC-MS 代谢组和脂质组，是所有下游差异分析的前提。
什么时候用
- 样本量大、分多天或多批次上机的代谢组和脂质组数据
- PCA 中 QC 样本沿进样顺序呈明显趋势而非聚成一团
- 合并不同时间采集的队列数据前需要先消除批间差异
- 非靶向数据需要过滤重复性差的特征以减少假阳性
- 尿液等样本浓度差异大，需要校正整体稀释程度
不适合的情况
- 实验没有设置混合 QC 样本：基于 QC 的漂移校正无从做起，只能用较弱的替代方法
- 分组与批次完全重合：任何校正都无法分开技术差异与生物学差异
- 把校正当作补救糟糕实验设计的手段：未随机化的进样顺序无法事后修复
需要准备的数据
- 特征强度矩阵
- 行为特征、列为样本的峰面积，来自 XCMS、MS-DIAL 等软件，需保留原始未归一化值
- 进样序列表
- 每个样本的进样顺序、批次编号和样本类型（样本、QC、空白），顺序必须与实际上机一致
- 混合 QC 样本
- 由全部或代表性样本等量混合制成，在序列开头、中间和结尾规律插入
- 内标信息（可选）
- 加入的内标名称和对应峰，可用于监测进样稳定性或做内标归一化
分析步骤
- 1
检查实验设计
确认样本进样顺序已按组别随机，QC 每隔若干个样本插入一次，批首有若干针平衡 QC。把 QC 和样本按进样顺序画出来，先确认序列信息与原始文件时间一致。
- 2
空白与 QC 预过滤
剔除在空白中信号与样本相当的特征，以及在大多数 QC 中缺失的特征。空白信号占比高的通常是溶剂、柱流失或残留污染，保留会干扰后续统计。
- 3
漂移校正
对每个特征，以进样顺序为自变量拟合 QC 强度的变化曲线，常用 LOESS（QC-RSC），也可用随机森林类方法（如 SERRF、statTarget 的 QC-RFSC），再用拟合值校正所有样本。校正后 QC 的强度应围绕常数平稳波动。
- 4
批间对齐
多批次数据在批内校正后，再把每批的 QC 中位数调到同一水平。也可以用 ComBat 等方法，但要把分组变量作为保护协变量，并确保各批中分组分布大致平衡。
- 5
按重复性过滤
计算每个特征在 QC 中的 RSD，常用经验阈值是 LC-MS 不超过 20%、GC-MS 不超过 30%。还可看 D-ratio，即 QC 变异相对样本变异的大小，比值高说明技术噪声主导该特征。
- 6
缺失值处理
先删除在各组都大量缺失的特征（常用经验规则是在至少一组中检出率达到 50% 至 80%）。剩余缺失若主要因低于检测限，可用最小值的一半等方法填补；随机缺失可考虑 kNN 或随机森林填补。
- 7
归一化与转换
对样本整体量差异进行校正，如 PQN、总离子流或内标归一化，再做 log 转换和缩放。最后用 PCA 对比校正前后，QC 应紧密聚在中心，批次不再是主成分的主要来源。
关键参数与决策
QC 插入频率
常见做法是每 5 到 10 个样本插入一次 QC，批首另加若干针平衡 QC。QC 太稀会让 LOESS 无法跟上漂移，平衡针不足会让序列开头的 QC 偏离并扭曲拟合曲线。
LOESS 平滑参数
span 决定拟合曲线的平滑程度。太小会追随 QC 的随机波动，导致过度校正；太大则跟不上真实漂移。可用交叉验证选择，或在多个值下比较校正后 QC 的 RSD。
RSD 阈值
阈值越严，保留的特征越少但越可靠。靶向数据可以更严，非靶向探索性分析常用 20% 或 30%。阈值应在看结果之前确定，并报告过滤前后的特征数。
归一化方法
PQN 和总量归一化都假设大多数特征浓度不变，适合尿液或体积不准的样本。若处理导致全局代谢水平改变，总量类方法会掩盖真实差异，此时宜用内标、细胞数或蛋白量归一化。
填补方法
低于检测限造成的缺失不是随机的，用均值或 kNN 填补会高估低丰度组。半最小值填补简单保守，但会压缩方差。应比较不同填补方法下主要结论是否稳定。
常见错误
- 进样顺序没有随机化：如果先跑完对照再跑病例，漂移会与分组完全混杂，校正时也可能把真实差异一并去掉。
- 用样本而不是 QC 估计漂移：样本本身含生物学差异，拟合出的趋势会吸收组间信号，导致过度校正。
- QC 太少或首批 QC 未平衡就做 LOESS：开头几针往往偏离，曲线在序列两端失真，校正后样本出现新的偏差。
- 先填补缺失值再做漂移校正：填补的常数会被当成真实信号参与拟合，改变校正曲线。一般先校正、再过滤、最后填补。
- 对已经 log 转换或缩放过的数据再做 PQN：归一化的假设建立在原始强度上，顺序错乱会产生难以解释的结果。
- 只看 PCA 中 QC 是否聚集就宣布校正成功：还需检查校正后 QC 的 RSD 分布和已知内标的稳定性。
结果怎么看
进样顺序趋势图
横轴进样顺序，纵轴某特征或内标强度，QC 和样本用不同颜色。校正前常见缓慢下降或批间台阶；校正后 QC 应在一条水平带内。若校正后样本出现明显反向趋势，说明过度校正。
校正前后 PCA 图
QC 在校正前常沿进样顺序拉成一条线，校正后应紧密聚在样本分布中心。若校正后 PC1 仍按批次分开，说明批间差异未消除；若组间分离在校正后完全消失，需检查是否组别与批次混杂。
QC RSD 分布图
校正前后 QC 中各特征 RSD 的分布对比。校正有效时，RSD 中位数下降，低于 20% 或 30% 的特征比例上升。如果 RSD 几乎不变，可能漂移不是主要问题，或者 QC 不具代表性。
过滤汇总表
依次列出原始特征数，以及经空白过滤、缺失过滤、RSD 过滤后剩余的数量。某一步骤剔除了大部分特征，需要回头检查峰提取参数或 QC 制备。
和相近方法怎么选
QC-RSC（LOESS）与 SERRF
QC-RSC 对每个特征单独用 LOESS 拟合 QC 漂移，原理简单透明，QC 足够密时效果稳定。SERRF 用随机森林并借助其他特征的相关性预测漂移，对复杂非线性漂移更灵活，但需要较多 QC，过拟合风险更高。
基于 QC 的校正与 ComBat
基于 QC 的方法能处理批内连续漂移，并且不依赖样本组成。ComBat 只按批次调整均值和方差，不处理批内漂移，且要求各批的生物学组成均衡。代谢组中通常先做 QC 漂移校正，再视情况使用 ComBat。
PQN 与总离子流归一化
总离子流归一化把每个样本的总强度调成一致，容易被少数高丰度特征左右。PQN 用中位商估计稀释系数，对少数特征的大幅变化更稳健，通常是尿液和非靶向数据的首选之一。
常见问题
QC 样本要插多少个？
常见做法是每 5 到 10 个实际样本插入一个混合 QC，批次开头另进若干针 QC 用于平衡系统，开头的平衡针不参与校正。总体上 QC 越多，漂移曲线估计越稳定，但也会占用仪器时间。
QC 的 RSD 阈值设多少？
常用经验阈值是 LC-MS 数据 QC 中 RSD 不超过 20% 至 30%，GC-MS 常放宽到 30%。靶向定量可更严。阈值是经验值，应结合数据质量和研究目的事先设定，并报告保留特征数。
批次效应校正会不会把真实差异去掉？
如果分组和批次严重混杂，会。基于 QC 的校正只利用 QC 估计漂移，相对安全；ComBat 等基于样本的方法若不保护分组变量，会把组间差异当作批次差异去除。设计阶段做好随机化最重要。
代谢组缺失值怎么填？
先区分原因：低于检测限的缺失常用半最小值或略低于检测限的值填补；随机缺失可用 kNN 或随机森林。缺失比例过高的特征应直接删除。不同填补方法会影响统计结果，建议做敏感性分析。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供特征强度矩阵和进样序列表并说明分组，它会先确认处理方案：漂移校正方法、批间对齐方式、RSD 与缺失过滤阈值、归一化方法。随后依次完成空白过滤、基于 QC 的漂移校正、批间对齐、重复性过滤、缺失值处理和归一化，并对比校正前后的 QC 指标。交付校正后矩阵、趋势图和脚本。
我有分 3 批上机的 400 个血清非靶向代谢组样本，每 8 针插一个 QC，帮我做 LOESS 漂移校正、批间对齐和 RSD 过滤，再用 PCA 看校正效果。