NMR 代谢组分析
NMR 代谢组以核磁共振氢谱（1H NMR）为主，一次采集即可看到样本中浓度较高的几十种代谢物，如乳酸、葡萄糖、氨基酸、酮体和肌酐。它样本前处理少、无破坏、重复性好，信号强度与质子数成正比，适合定量和大规模队列，但灵敏度低于质谱，通常只能看到微摩尔以上的代谢物。常见样本为血清、尿液和组织提取物。分析核心是把谱图处理成可比较的矩阵：校准化学位移、修正相位与基线、对齐峰位，再用分段积分或分峰拟合得到含量，最后做多变量统计和代谢物指认。
什么时候用
- 大样本队列的代谢表型分析，需要批间稳定、可重复的数据
- 尿液、血清等生物流体的高浓度代谢物普查
- 需要无损检测、样本还要用于其他实验的情况
- 需要绝对定量且不想为每个代谢物准备标准曲线
- 与 LC-MS 互补，补充糖类、有机酸等极性小分子信息
不适合的情况
- 目标代谢物为纳摩尔级的低丰度信号分子：NMR 灵敏度不够
- 需要区分大量结构相近的脂质分子种类：信号重叠严重，宜用质谱脂质组
- 样本量极少（如微量组织）且没有微量探头：信噪比不足
需要准备的数据
- 原始 FID 或处理后谱图
- Bruker 等仪器的原始 FID 数据，或已傅里叶变换的谱图；需同一脉冲序列和采集参数
- 采集参数
- 脉冲序列（如 NOESY 预饱和、CPMG）、谱宽、扫描次数、温度和场强，影响后续处理与比较
- 化学位移参比信息
- 样本中加入的 TSP 或 DSS 浓度，血清中也常用葡萄糖或乳酸峰作为位移参照
- 样本信息表
- 分组、采集批次、样本体积、pH 或缓冲液信息；尿液样本最好有肌酐或渗透压数据
分析步骤
- 1
傅里叶变换与相位
对 FID 施加适当的线宽展宽（常见约 0.3 Hz 的指数窗）后做傅里叶变换，再做零级和一级相位校正。校正好的谱图各峰两侧对称、基部不出现负向下沉。
- 2
基线与位移校准
用多项式或样条拟合扣除基线，再把 TSP 或 DSS 的甲基信号定为 0 ppm。血清中参比物可能与蛋白结合而变宽，常改用乳酸或葡萄糖的已知峰位校准。
- 3
去除无关区域
剔除水峰残余区域（约 4.7 至 5.0 ppm），尿液还常剔除尿素区域，以及参比峰和谱图两端无信号区域。这些区域受预饱和和样本状态影响大，保留会引入大量噪声。
- 4
峰对齐
pH 和离子强度差异会让柠檬酸、组氨酸等峰发生漂移，需要用 icoshift 等方法分段对齐。对齐后叠加谱图中同一代谢物的峰应落在同一位置，没有拖成宽带。
- 5
积分或分峰定量
常用等宽分段积分（如 0.01 至 0.04 ppm 一段）快速得到矩阵；需要代谢物水平结果时，用分峰拟合或去卷积工具（如 BATMAN、ASICS、Chenomx）把重叠峰分开定量。
- 6
归一化与缩放
尿液浓度差异大，常用概率商归一化（PQN）或按肌酐校正；血清多用总面积或不归一化。统计前常做 Pareto 缩放，在保留高丰度信号结构的同时避免它们完全主导模型。
- 7
多变量统计与指认
先用 PCA 查看整体分布和离群样本，再用 OPLS-DA 寻找区分组别的谱区，并做置换检验与交叉验证。对重要谱区结合数据库、STOCSY 和二维谱（TOCSY、HSQC）指认代谢物。
关键参数与决策
脉冲序列
1D NOESY 预饱和适合尿液和提取物，信号定量性好；血清血浆中大分子会产生宽峰，常加采 CPMG 序列抑制蛋白和脂蛋白信号，以突出小分子。两者数据不宜混合分析。
分段宽度
宽段对峰位漂移更宽容，但会把相邻代谢物合并；窄段分辨更细，但对对齐要求更高。可以用按峰形划分的智能分段，使每段尽量对应一个峰。
归一化方式
PQN 假设大多数代谢物浓度不变，用中位数比值估计稀释因子，适合尿液。若组间真实存在全局浓度变化，任何总量类归一化都会削弱差异，此时应先查看稀释因子是否与分组相关。
OPLS-DA 验证
OPLS-DA 很容易对小样本过拟合，必须报告交叉验证的 Q² 和置换检验结果。R² 高而 Q² 低或置换检验不通过，说明分组差异不可靠。
常见错误
- 混合不同场强、温度或脉冲序列采集的谱图：峰形、化学位移和弛豫加权都不同，会产生与分组无关的伪差异。
- 未对齐就分段积分：pH 引起的峰漂移会让同一代谢物分到不同段，统计上表现为假的升降。
- 保留水峰区域参与建模：预饱和效果在样本间不同，水峰残余常成为区分组别的最大因素，但没有生物学意义。
- 把分段的 ppm 值直接当作代谢物：一个代谢物有多个峰，一个谱段也可能包含多个代谢物，应指认后再下结论。
- 只报告 OPLS-DA 得分图分组清楚：有监督模型在任何数据上都能把组分开，没有置换检验和交叉验证就没有说服力。
- 样本 pH 未控制：尿液 pH 变化大，未用缓冲液会使峰位严重漂移，增加对齐和指认难度。
结果怎么看
叠加谱图
把各组平均谱或全部谱叠加显示，用于检查相位、基线和对齐质量。同一峰在样本间位置一致、基线平直为好；某些样本整体偏移或宽峰异常，提示处理或采样有问题。
PCA 与 OPLS-DA 得分图
PCA 看样本整体分布和离群点，QC 样本应聚在一起。OPLS-DA 得分图看组间分离，需配合 Q² 和置换检验结果解读；离群样本应回到原始谱图查找原因。
载荷图或 S-plot
以谱图形式显示的载荷系数，颜色常表示与分组的相关强度。峰形完整、颜色一致的区域对应可信的差异代谢物；载荷图呈现尖锐导数形状时，往往是峰漂移而非浓度变化。
代谢物定量表
列出指认的代谢物、所用峰位、浓度或相对含量及组间检验结果。同一代谢物多个峰给出的结论应一致，若不一致说明某个峰受到重叠干扰。
和相近方法怎么选
NMR 与 LC-MS 代谢组
LC-MS 灵敏度高、覆盖代谢物多，但受离子抑制和批次漂移影响较大，定量需要标准品。NMR 覆盖少，但重复性好、可直接定量、结构信息明确。大队列常以 NMR 做稳定的主数据，LC-MS 扩展覆盖。
分段积分与分峰拟合
分段积分快速、无需先验知识，适合探索性分析，但一段可能混合多个代谢物。分峰拟合根据代谢物参考谱分解重叠峰，得到代谢物水平浓度，但依赖参考库，未知峰无法拟合。
NOESY 与 CPMG 谱
NOESY 预饱和谱保留全部信号，包括蛋白和脂蛋白宽峰，适合定量和脂蛋白相关分析。CPMG 利用弛豫差异抑制大分子信号，小分子峰更清楚，但各峰受 T2 加权影响，绝对定量需谨慎。
常见问题
TSP 和 DSS 选哪个做内标？
两者都以甲基峰定为 0 ppm。TSP 的化学位移对 pH 较敏感，DSS 相对稳定。血清血浆中两者都可能与蛋白结合导致峰变宽、定量偏低，此时常改用乳酸或葡萄糖峰校准位移，用外标或电子参比定量。
NMR 峰怎么指认到代谢物？
先根据化学位移、峰的裂分形式和偶合常数与 HMDB、BMRB 等数据库比对，再用 STOCSY 找同一代谢物的其他峰，必要时采集 TOCSY、HSQC 等二维谱或加入标准品确认。只凭一个峰的位置指认可信度较低。
尿液 NMR 数据为什么要做 PQN？
尿液受饮水影响，整体稀释程度差别很大。PQN 用每个样本相对参考谱的中位数比值估计稀释倍数，比总面积归一化更不易受个别高浓度代谢物干扰。也可以用肌酐校正，但肌酐本身可能与分组相关。
OPLS-DA 的 Q² 多少才算好？
没有统一硬标准，一般 Q² 越接近 R²Y 越好，很多研究把 Q² 大于 0.4 到 0.5 视为有一定预测能力的经验参考。更重要的是置换检验：原始模型的 Q² 应明显高于置换后的分布。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中说明样本类型、脉冲序列和分组并提供谱图文件，它会先确认处理方案：位移参比、剔除区域、分段或分峰方式与归一化方法。随后完成相位基线校正、位移校准、峰对齐和积分定量，再做 PCA、OPLS-DA 与置换检验，并给出候选指认。交付叠加谱图、载荷图、代谢物表和脚本。
我有 80 份尿液 1H NMR 的 Bruker 原始数据，分疾病组和对照组，帮我做相位基线校正、对齐、PQN 归一化和 OPLS-DA，找出差异代谢物。