脂质组学分析
脂质不仅是膜的组成和能量储存形式，也作为信号分子参与炎症、胰岛素抵抗、铁死亡和肿瘤代谢。脂质组学在一次分析中测定上百到上千种脂质，主要类别包括甘油磷脂（PC、PE、PI、PS 等）、鞘脂（神经酰胺、鞘磷脂）、甘油酯（TG、DG）、固醇酯和游离脂肪酸。与一般代谢组相比，脂质结构高度相似、同分异构体多，鉴定需要依靠特征碎片离子并区分注释层级，定量需要每个类别的内标。分析结果通常在三个层面解读：单个脂质分子、脂质类别总量，以及脂肪酰链长度与不饱和度的整体分布。
什么时候用
- 高脂饮食、肥胖或脂肪肝模型中比较肝脏或血浆脂质谱
- 研究铁死亡时观察含多不饱和脂肪酸磷脂的变化
- 评估药物或基因敲除对鞘脂和神经酰胺代谢的影响
- 血浆脂质与心血管或代谢疾病风险关联的队列研究
- 细胞膜脂组成变化与膜流动性、信号转导的关系研究
不适合的情况
- 需要确定双键位置或 sn 位置：常规 LC-MS/MS 一般无法区分，需专门的碎裂技术
- 只关心少数几个已知脂质的准确浓度：靶向 MRM 定量更合适
- 用一般代谢组的水相提取样本做脂质分析：大部分脂质未被提取
需要准备的数据
- 质谱原始数据
- 正负离子模式的 LC-MS/MS 数据，记录色谱柱类型（C18、C30 或 HILIC）和采集方式
- 鉴定与峰面积表
- LipidSearch、MS-DIAL 等软件输出，需含脂质名、加合离子、保留时间、碎片证据等级和各样本峰面积
- 内标信息
- 加入的各类别内标名称、浓度和加入量；最好覆盖主要脂质类别，用于按类别校正和半定量
- 样本与质控信息
- 分组、组织重量或蛋白量、上机顺序，以及混合 QC 样本和提取空白的位置
分析步骤
- 1
提取与上机设计
常用 Folch、Bligh-Dyer 或 MTBE 法提取，提取前加入内标。上机顺序随机化，定期插入混合 QC 和空白。QC 在 PCA 中聚在一起，说明全程仪器状态稳定。
- 2
峰提取与鉴定
用 LipidSearch 或 MS-DIAL 进行峰提取、加合离子识别和碎片匹配。检查主要类别的特征碎片，例如正离子模式下 PC 和 SM 的磷酸胆碱头基碎片 m/z 184.07，PE 的中性丢失 141。
- 3
结果核查与去冗余
同一脂质常以多种加合离子出现，需要合并或只保留一个代表离子；同时剔除源内碎裂产物，如由 PC 产生的假 LPC 峰。保留时间应随链长和双键数呈规律变化，不符合规律的注释需要复查。
- 4
内标定量与归一化
用同类别内标的峰面积比乘以内标浓度得到半定量浓度，再按组织重量、蛋白量或细胞数归一化。比较内标在全部样本中的变异，变异过大的样本可能存在提取或进样问题。
- 5
质控过滤
计算每个脂质在 QC 样本中的 CV，常见做法是去除 CV 超过 20% 到 30% 的脂质，并去除在空白中信号高的特征。上机时间长时，需先做信号漂移校正。
- 6
统计与差异分析
对数转换后做 PCA 和 PLS-DA 或 OPLS-DA 观察组间分离，用 t 检验或 limma 筛选差异脂质并做 FDR 校正。多变量模型需做置换检验，防止过拟合。
- 7
类别与结构特征分析
把差异结果汇总到脂质类别、总碳数和总双键数层面，例如比较各类别总量、TG 链长分布和 PUFA 磷脂比例。也可用 LION 或 lipidr 做脂质集富集，判断变化是否集中在某类结构特征。
关键参数与决策
色谱分离方式
反相色谱按疏水性分离，同一类别中不同链长和不饱和度的分子能分开；HILIC 按头基极性分离，同类脂质共流出，便于用同类内标校正。按研究重点选择，二者也可互补。
注释层级
只确认类别和总碳数、双键数时写作物种水平，如 PC 34:1；能从碎片确认两条酰链时写作分子种水平，如 PC 16:0_18:1；sn 位置确定后才用斜线。报告时不要超出证据。
加合离子选择
不同类别的优势离子不同，如 TG 正离子模式常见 [M+NH4]+，PC 在负离子模式常以甲酸或乙酸加合离子出现。为每个类别固定一种主定量离子，避免同一脂质重复计数。
QC CV 阈值
阈值越严保留的脂质越可靠但数量越少。常见经验范围是 20% 到 30%，低丰度脂质整体 CV 较高，可按丰度分层评估过滤的影响。
常见错误
- 忽视 II 型同位素重叠：多一个双键的脂质的 M+2 同位素峰与目标脂质质量接近，未校正会高估饱和度更高的那一个。
- 接受软件给出的分子种水平注释而不核对碎片：缺少酰链碎片证据时，PC 16:0_18:1 这样的注释并不成立。
- 没有内标就跨类别比较峰面积：不同类别离子化效率差异很大，峰面积大小不代表含量高低。
- 把源内碎裂产物当作内源脂质：PC 在离子源中丢失脂肪酰链会形成与 LPC 同质量的峰，若与 PC 同时出峰需排除。
- 样本处理用塑料管长时间接触有机溶剂：塑料中的增塑剂和聚合物会引入大量干扰峰，提取空白中可以看到。
结果怎么看
脂质类别组成图
以堆叠柱状图展示各组主要脂质类别的总量或占比。某一类别整体变化，例如神经酰胺升高，比单个分子变化更有生物学解释力；如果所有类别同步升降，先检查归一化是否合适。
差异脂质火山图
每个点是一个脂质，横轴 log2 倍数变化，纵轴 -log10(FDR)，点可按类别着色。显著点集中在同一类别时提示通路层面的变化；散布在各类别时，需结合富集分析判断是否有规律。
链长与不饱和度气泡图
横轴为总碳数，纵轴为总双键数，气泡大小和颜色表示倍数变化或显著性，常按类别分面展示。高双键数磷脂集中下降，可提示 PUFA 磷脂消耗，与脂质过氧化相关研究相呼应。
QC 样本 PCA 与 CV 分布
QC 样本在 PCA 中应紧密聚集于中心，CV 分布大部分低于设定阈值。QC 随上机顺序在主成分上漂移，提示需要信号漂移校正；QC 很分散时，组间差异结论不可靠。
和相近方法怎么选
脂质组学与非靶向代谢组
非靶向代谢组多用水相或混合提取，覆盖氨基酸、有机酸等极性小分子，脂质只是一部分，注释多停留在质量匹配。脂质组学用有机相提取，按类别碎片规则鉴定，并以类别内标定量，脂质覆盖和结构信息更完整。
LC-MS 与鸟枪法脂质组学
鸟枪法直接进样不经色谱，速度快、类别内标校正方便，但同分异构体和低丰度脂质易受离子抑制。LC-MS 先分离再检测，能区分更多同分异构体和低丰度分子，但通量较低、保留时间需要校准。
LipidSearch 与 MS-DIAL
LipidSearch 是 Thermo 的商业软件，与其仪器数据配合好，按碎片规则给出鉴定等级。MS-DIAL 免费、支持多厂商数据和 DIA 采集，内置较大的脂质谱图库。两者都需要人工核查碎片证据和保留时间规律。
常见问题
PC 34:1 和 PC 16:0_18:1 有什么区别？
PC 34:1 只说明是一种磷脂酰胆碱，两条酰链合计 34 个碳和 1 个双键，可能是多种组合。PC 16:0_18:1 进一步通过碎片确认了两条酰链分别为 16:0 和 18:1，但未确定哪条在 sn-1 位。只有确定 sn 位置时才写作 PC 16:0/18:1。
脂质组学一定要加内标吗？
做相对比较时，没有内标也可以比较同一脂质在不同组间的变化。但要估计浓度、比较不同类别总量或校正提取效率，就需要每个主要类别至少一个内标。常用氘代或奇数链脂质作为内标，因为它们在样本中天然含量极低。
LipidSearch 鉴定出的脂质都可信吗？
不一定。需查看其鉴定等级和碎片证据，去除只有一级质量匹配的条目，合并同一脂质的多个加合离子，检查保留时间是否符合链长和双键规律，并排除源内碎裂产物。核查后数量通常明显少于软件初始输出。
差异脂质怎么做富集分析？
KEGG 通路中脂质分子注释有限，直接做代谢通路富集意义不大。更常用的是脂质集富集：按类别、链长、不饱和度、细胞定位等脂质本体属性分组，用 LION 或 lipidr 等工具检验差异是否集中在某类特征上。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供 LipidSearch 或 MS-DIAL 导出的脂质鉴定与峰面积表、内标信息和样本分组后，会先确认注释层级、归一化方式和质控标准，再进行脂质组学分析：去冗余与质控、内标校正、差异脂质统计，以及类别、链长和不饱和度汇总。交付差异脂质表、类别组成图、火山图、链长气泡图、报告和可复现脚本。
我有对照和高脂饮食小鼠各 8 只的肝脏脂质组 LipidSearch 结果，带内标，想找差异脂质并看 TG 链长和不饱和度怎么变