质谱成像与空间代谢组分析（MALDI、DESI）
质谱成像（MSI）在组织切片上逐点采集质谱，每个像素得到一张质谱图，从而看到成百上千种代谢物、脂质或药物分子在组织中的空间分布。常见技术有 MALDI（需要喷涂基质，空间分辨率可达数微米到数十微米）、DESI（无需基质，常温常压下操作，分辨率通常较低）和 SIMS（分辨率最高但分子碎片多）。数据通常以 imzML 加 ibd 文件存储。分析流程包括归一化、峰提取与对齐、去噪、按像素做无监督分割识别化学区域、比较不同区域或组别的离子强度，以及基于精确质量数的代谢物注释。它常用于肿瘤代谢异质性、药物组织分布和脂质重编程研究，结果是相对定量。
什么时候用
- 研究肿瘤内部不同区域（坏死区、增殖区、侵袭前沿）的代谢物或脂质差异
- 观察药物及其代谢物在组织中的分布，判断是否到达靶区域
- LC-MS 发现差异代谢物后，想知道它在组织中定位于哪种结构
- 与 H&E 或空间转录组相邻切片配准，把代谢分布与组织学或基因表达对照
- 在无先验的情况下按化学组成把组织自动分割成若干区域
不适合的情况
- 需要绝对定量浓度，MSI 受离子抑制和基质效应影响，通常只能做相对比较
- 需要区分同分异构体，仅靠精确质量数无法区分，需要串联质谱或离子淌度等补充
- 只有一张切片却要比较两组样本的差异代谢物
需要准备的数据
- imzML 与 ibd 文件
- 开放格式，需成对存放且文件名一致；注意是连续模式还是处理模式，影响读取和后续峰对齐方式。
- 采集参数
- 离子模式（正或负）、质量范围、像素尺寸、基质种类，决定可检测的分子类型和加合离子形式。
- 组织学图像
- 同一或相邻切片的 H&E 或免疫组化扫描图，用于配准和划定感兴趣区域，需记录与 MSI 的方向关系。
- 样本信息
- 每张切片对应的样本、组别、制片和采集批次；同一载玻片上放置不同组样本有助于减少批次影响。
分析步骤
- 1
读取与总体检查
用 Cardinal 或 pyimzML 读入数据，绘制总离子流（TIC）图和平均质谱。TIC 图上组织轮廓应清楚，若出现条带状或逐行强弱交替，提示采集过程中仪器信号漂移。
- 2
质量校准与峰提取
以已知基质峰或内源离子做质量校准，然后在平均质谱或每个像素上识别峰，按 ppm 容差合并对齐。检查校准后已知离子的质量误差是否稳定在仪器精度范围内。
- 3
归一化与去噪
常用 TIC 或 RMS 归一化，有内标时可用内标归一化。对每个离子图像做热点截断（如 99 分位数）以免个别像素拉伸色阶，必要时做空间平滑。比较归一化前后关键离子图像是否被异常改变。
- 4
去除背景和基质峰
将组织外区域的像素作为背景，剔除在组织外同样高或更高的峰，这类峰多来自基质或污染。只保留在组织内显著高于背景的离子用于后续分析。
- 5
无监督空间分割
对像素做降维和聚类，如 Cardinal 中的空间收缩质心法或二分 k-means，得到化学组成相似的区域。把分割结果与 H&E 对照，看是否对应已知结构，再找出驱动各区域的特征离子。
- 6
区域与组间比较
按组织学标注或分割结果划定区域，在每张切片中先计算区域平均强度，再在样本间比较。多张切片、多个样本的差异分析必须以样本为单位，不能把像素当作独立观测。
- 7
代谢物注释
用精确质量数匹配 HMDB、LIPID MAPS 等数据库，考虑常见加合离子；也可上传到 METASPACE，借助同位素模式和空间一致性在给定 FDR 下注释。关键分子用组织原位 MS/MS 或 LC-MS/MS 确认。
关键参数与决策
归一化方法
TIC 归一化最常用，但当少数高丰度离子在不同区域差异很大时会扭曲其他离子的相对强度；此时可比较 RMS 或中位数归一化，有可靠内标时优先用内标。结论最好在两种归一化下都成立。
峰合并的质量容差
按仪器质量精度设定 ppm 容差，高分辨仪器可用较小容差。容差过大会把相邻不同分子合成一个峰，过小会把同一分子拆成多个峰，可通过查看已知离子的峰形来调整。
加合离子与离子模式
正离子模式常见 [M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+，负离子模式常见 [M-H]-。注释时应限定合理的加合类型，同一分子的多个加合离子空间分布应一致，可借此互相印证。
分割的聚类数与平滑程度
聚类数太少会合并不同结构，太多会把噪音分成区域。空间平滑参数越大区域越连续但边界越模糊。建议尝试多个设置，选择能与组织学结构对应、且在相邻设置下稳定的结果。
常见错误
- 把像素当作独立样本做 t 检验：一张切片有数万像素，几乎任何差异都会显著，但它们来自同一个样本，结论无法推广。
- 盲目使用 TIC 归一化：坏死区或富含脂质区域 TIC 差异巨大，归一化后可能制造出原本不存在的区域差异。
- 把精确质量匹配当作确定鉴定：同一质量数可能对应多个同分异构体或不同加合离子，未经串联质谱确认只能写作推定注释。
- 不排除基质相关峰：基质簇离子和污染物在组织上下都存在，若未与组织外背景比较，会被误判为组织特异分子。
- 不同切片分批采集且每批只放一个组：仪器灵敏度随时间变化，组间差异与批次完全混杂，后期无法校正。
结果怎么看
离子图像
单个 m/z 在组织上的强度分布图。看分布是否与组织结构吻合、组织外是否有信号；色阶需经热点截断，不同切片比较时应使用统一色阶，否则视觉差异可能只是色阶不同。
空间分割图
每个像素按聚类结果着色，并与 H&E 叠加对照。理想情况下分割区域对应肿瘤、基质、坏死等结构；若分割主要沿采集方向形成条带，说明存在采集漂移而非生物学区域。
区域特征离子表
列出每个区域显著富集的 m/z、倍数变化、统计量和推定注释。重点看在多个样本中重复出现的特征离子；只在单张切片中显著的离子应标注为候选。
注释结果与可信等级
每个离子的候选分子、加合形式、质量误差和注释依据，如 METASPACE 的 FDR 等级。质量误差明显偏大或多个候选并列时，不宜在正文中直接写成具体分子名称。
和相近方法怎么选
质谱成像与 LC-MS 非靶向代谢组
LC-MS 先经色谱分离，检测覆盖面更广、可做 MS/MS 鉴定和更准确的相对定量，但组织被匀浆后空间信息丢失；MSI 保留空间分布但受离子抑制影响、同分异构体难分。常见策略是 LC-MS 发现与鉴定，MSI 定位。
MALDI 与 DESI
MALDI 需喷涂基质，空间分辨率高，适合精细结构和小分子到蛋白的多种分析物，但基质峰会干扰低质量区；DESI 无需基质、制样简单，适合脂质和小分子的快速成像，分辨率通常较低。
空间代谢组与空间转录组整合
空间转录组给出基因表达和细胞类型，质谱成像给出代谢产物分布，两者在相邻切片上配准后可关联代谢酶表达与产物分布。但两者分辨率和坐标系不同，配准误差会影响细胞层面的结论，宜在区域层面比较。
常见问题
质谱成像数据用什么软件分析？
开源工具常用 R 的 Cardinal，Python 可用 pyimzML 读数据再结合 scikit-learn 分析；METASPACE 是在线注释平台；商业软件如 SCiLS Lab 常随 Bruker 仪器提供。选择时主要看是否支持 imzML 读写和是否需要与其他组学流程衔接。
质谱成像能定量吗？
常规 MSI 是相对定量，同一分子在不同区域或切片之间可比较强度高低，但受离子抑制、基质结晶和组织类型影响，不能直接换算成浓度。需要定量时可在切片上喷涂同位素内标或使用组织模拟标准曲线，并配合 LC-MS 验证。
TIC 归一化什么时候不适用？
当某些区域由少数高丰度离子主导，如富含脂质的区域或基质峰较强的区域，TIC 会在这些区域被放大，导致其他离子强度被系统性压低。可对比 RMS、中位数或内标归一化，看结论是否稳定。
MALDI 成像的 m/z 怎么注释成代谢物？
先按精确质量和常见加合离子在 HMDB、LIPID MAPS 等数据库中检索候选，再结合同位素分布判断；METASPACE 可在控制 FDR 的条件下批量注释。仅靠质量匹配属于推定注释，关键分子需用组织原位 MS/MS 或标准品确认。
质谱成像和 H&E 怎么配准？
最好在同一张切片采集后再做 H&E 染色，或用紧邻切片。先在 MSI 中选能显示组织轮廓的离子或 TIC 图，再与 H&E 选取若干对应标志点做仿射或非刚性配准，检查组织边缘和明显结构是否对齐。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中提供 imzML 文件、采集参数和组织学图像后，会先确认离子模式、归一化方式和比较分组，再完成数据读取、质量校准与峰提取、归一化和背景峰剔除、无监督空间分割、区域与组间比较以及基于精确质量的代谢物推定注释。交付离子图像、分割图、区域特征离子表、注释表和可复现脚本。
我有 8 张小鼠肝癌组织的 MALDI 成像数据（imzML，负离子模式），想找肿瘤区和癌旁区差异分布的脂质，并配合 H&E 图划区域。