稳定同位素示踪与代谢流分析
代谢物浓度只反映某一时刻的库大小，说不清物质流动得多快、从哪里来。稳定同位素示踪给细胞、组织或动物提供 13C、15N、2H 标记的底物，如 [U-13C6] 葡萄糖，一段时间后用质谱测定下游代谢物中带 0、1、2 个重同位素的分子比例，即质量同位素分布（MID）。根据标记模式可定性判断通路活性，例如柠檬酸 M+2 主要来自葡萄糖经丙酮酸脱氢酶进入 TCA 循环；把 MID 与代谢网络模型拟合则能定量估计各反应通量，即 13C 代谢流分析（13C-MFA）。
什么时候用
- 判断某个代谢物的碳主要来自葡萄糖、谷氨酰胺还是脂肪酸
- 比较处理组与对照组在糖酵解、TCA 循环或磷酸戊糖途径上的通路活性
- 研究还原羧化、丝氨酸合成等特定分支是否被激活
- 细胞培养体系中定量估计中心碳代谢的绝对通量
- 动物体内输注示踪剂，比较不同组织对底物的利用
不适合的情况
- 只想知道代谢物多还是少：浓度变化用常规定量代谢组更直接
- 未达到同位素稳态却用稳态 MFA 拟合：通量估计会系统性偏差
- 仅凭标记比例升高就断言通量增大：库大小和稀释也会改变标记比例
需要准备的数据
- 同位素异构体峰面积
- 每个代谢物 M+0 到 M+n 的峰面积，来自 LC-MS 或 GC-MS；GC-MS 需注明衍生化后的碎片和分子式
- 代谢物化学式
- 用于天然丰度校正，需包括衍生化基团带入的原子；分辨率信息影响 13C 与 15N 是否可分开
- 示踪剂信息
- 标记底物名称、标记位置、同位素纯度、标记时间点和培养基组成
- 胞外速率（做 MFA 时）
- 细胞增殖速率、葡萄糖消耗、乳酸分泌、谷氨酰胺消耗等速率，用于约束模型
- 未标记对照样本
- 同条件下用未标记底物培养的样本，用于检验校正是否准确，M+0 应接近 1
分析步骤
- 1
设计示踪实验
根据问题选示踪剂：[U-13C6] 葡萄糖看整体碳流向，[1,2-13C2] 葡萄糖区分糖酵解与氧化磷酸戊糖途径，[U-13C5] 谷氨酰胺看 TCA 回补与还原羧化。设置多个时间点确认是否达到同位素稳态。
- 2
提取同位素峰
对每个代谢物按理论 m/z 提取 M+0 至 M+n 的色谱峰并积分，积分窗口与保留时间在同位素之间保持一致。高分辨数据还需确认相邻同位素峰没有被其他化合物干扰。
- 3
天然丰度校正
用 IsoCor、AccuCor、IsoCorrectoR 等工具扣除碳、氢、氧、氮、硅等元素天然重同位素的贡献，并按示踪剂纯度校正。未标记对照校正后 M+0 应接近 100%，否则检查分子式或衍生化碎片设置。
- 4
计算 MID 与标记分数
校正后各同位素异构体归一化得到 MID，并计算平均标记分数（各 M+i 按 i 加权求和再除以碳数）。组间比较时同时给出代谢物总量，避免只凭标记比例下结论。
- 5
确认同位素稳态
比较相邻时间点的 MID，若关键代谢物（如柠檬酸、苹果酸）的 MID 已基本不变，可按稳态分析；仍在变化时需要用非稳态 MFA，或只做定性的标记模式解读。
- 6
构建模型并拟合通量
定义反应网络及每个反应的碳原子转移关系，输入校正后的 MID 和胞外速率，用 INCA、13CFLUX2、Metran 等基于 EMU 的软件做最小二乘拟合，多次随机初始值重启以避免陷入局部最优。
- 7
评估拟合与置信区间
用加权残差平方和做卡方检验，落在可接受范围内说明模型与数据相容。再用参数延拓或蒙特卡罗方法估计每个通量的置信区间，区间很宽的通量说明数据不足以确定它。
关键参数与决策
示踪剂选择
不同示踪剂对不同通量的分辨能力不同。全标记葡萄糖信息量大但对磷酸戊糖途径不敏感，位置特异标记更适合拆分分支。条件允许时用两种示踪剂平行实验，可显著缩小通量置信区间。
标记时长
糖酵解中间体通常几分钟内接近稳态，TCA 循环中间体需要更长时间，而核苷酸、脂质可能需要一天以上。时长要根据目标代谢物来定，并用时间序列验证。
测量误差设置
MFA 拟合依据测量标准差给各数据点加权。误差设得过小会让卡方检验总是不通过，设得过大会让任何模型都看似合格，宜根据技术重复估计，常见经验下限在 0.5% 到 1% 的 MID 量级。
模型边界与假设
需要说明是否区分胞质与线粒体代谢池、是否包含 CO2 交换和未标记碳源稀释。模型过简会使拟合不通过，过繁则参数不可辨识，置信区间变宽。
常见错误
- 不做天然丰度校正就直接比较 M+1、M+2：天然 13C 本身会贡献约 1.1% 每个碳的信号，碳数越多偏差越大。
- GC-MS 校正时漏掉衍生化基团：TBDMS 等衍生基团带入大量碳和硅，分子式不完整会使校正后的 MID 出现负值。
- 把标记分数高等同于通量大：标记分数受代谢物库大小、未标记来源稀释和交换反应影响，需结合 MFA 或额外实验判断。
- 用含未标记葡萄糖或谷氨酰胺的血清：未透析的血清会稀释示踪剂，应使用透析血清并在模型中考虑稀释。
- MID 出现明显负值或总和不为 1 仍继续分析：通常提示积分窗口、分子式或峰干扰有问题，需回头检查原始峰。
- 只拟合一次就报告通量：最小二乘问题常有多个局部最优，应多次随机初始化并检查是否收敛到同一解。
结果怎么看
MID 堆叠柱状图
每个代谢物一组柱，柱内按 M+0 到 M+n 分色。看主要同位素异构体的变化：如葡萄糖示踪下柠檬酸 M+2 降低而 M+3 升高，提示丙酮酸羧化增强。对照组 M+0 应占绝大部分。
标记分数比较图
展示各代谢物平均标记分数的组间差异。需与库大小一起看：标记分数下降而总量上升，可能只是未标记来源增加，并不代表来自该示踪剂的通量减少。
通量分布图
把拟合得到的通量值和置信区间标在代谢网络上，常以葡萄糖摄取速率为 100 做归一化。重点关注置信区间不重叠的组间差异，区间跨越零的通量不宜解释方向。
拟合优度报告
包括残差平方和、自由度、卡方检验结果以及每个测量值的残差。个别代谢物残差特别大，提示模型缺少某条反应或该测量有干扰，应检查后再决定是否修改模型。
和相近方法怎么选
13C-MFA 与 FBA
FBA 基于基因组尺度代谢模型和化学计量约束，用优化目标预测通量，不需要标记数据，但结果依赖目标函数假设。13C-MFA 用实测标记数据估计中心代谢通量，规模小但有实验依据。两者可结合，用 MFA 结果约束 FBA。
同位素示踪与常规代谢组
常规代谢组测的是库大小，适合发现哪些代谢物变了。同位素示踪回答碳从哪来、流向哪里。库大小不变时通量也可能变化，因此怀疑代谢重编程时，示踪实验能提供浓度数据给不了的信息。
稳态 MFA 与非稳态 MFA
稳态 MFA 要求代谢和同位素均达到稳态，数据只需一个时间点。非稳态 MFA 用多个早期时间点的标记动态，适合标记慢的体系或自养生物，但需要库大小数据，计算和实验要求都更高。
常见问题
MID 和标记分数有什么区别？
MID 是某个代谢物中 M+0、M+1……各同位素异构体所占比例，保留了标记模式信息。标记分数是把 MID 按标记碳数加权得到的一个数，表示平均有多少比例的碳被标记。机制推断主要依赖 MID，标记分数适合做总体比较。
为什么一定要做天然丰度校正？
自然界碳中约有 1.1% 是 13C，氢、氧、氮、硅也有重同位素。即使没有示踪剂，大分子也会有可观的 M+1 和 M+2。不校正会把天然信号当作示踪信号，碳数多或衍生化后的分子偏差更明显。
柠檬酸 M+5 说明什么？
在 [U-13C5] 谷氨酰胺示踪中，柠檬酸 M+5 通常被解读为还原羧化的标志，即 α-酮戊二酸被还原羧化生成异柠檬酸和柠檬酸。氧化途径产生的主要是 M+4。解读时需结合缺氧、线粒体功能等条件。
怎么判断达到同位素稳态？
最直接的方法是在至少两个较晚时间点取样，若目标代谢物的 MID 不再明显变化即可视为稳态。也可以参考类似体系的经验时长，但不同细胞和代谢物差异很大，最好在自己的体系中验证。
没有 MFA 软件能只做定性分析吗？
可以。很多研究只报告校正后的 MID 和标记分数，根据特征同位素异构体推断通路活性变化，例如乳酸 M+3、柠檬酸 M+2。定性结论应表述为通路贡献的相对变化，而不是绝对通量。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 中说明示踪剂、标记时间、代谢物列表和数据文件，它会先确认方案：校正用的分子式与示踪剂纯度、是否做 MFA、模型含哪些反应。随后读取同位素异构体峰面积，完成天然丰度校正，计算 MID 与标记分数并做组间比较，需要时拟合通量并评估置信区间。交付 MID 图、标记分数表和可复现脚本。
我用 U-13C6 葡萄糖标记了对照和敲低细胞 24 小时，有 LC-MS 同位素峰面积表，帮我做天然丰度校正并比较 TCA 中间体的 MID。