代谢网络建模与通量平衡分析
通量平衡分析（FBA）把细胞代谢写成一个化学计量矩阵，假设代谢物浓度处于稳态，即每种中间代谢物的生成速率等于消耗速率，再给每个反应加上可行范围的上下界，最后用线性规划求一组使设定目标最大的反应速率。它不需要酶动力学参数和代谢物浓度，只靠反应的化学计量关系和边界条件，因此可以在基因组尺度上一次性计算上千个反应。常见用途是预测生长速率和产物理论产率、模拟基因敲除的后果、筛选提高目标产物的改造位点。典型输入是一个基因组尺度代谢模型文件和一组培养基与底物吸收约束。要特别注意，FBA 给出的是在设定假设下的一种可行最优解，不是实测通量。
什么时候用
- 估算某个产物在给定底物上的理论最大产率，判断改造空间还有多大
- 在基因组尺度上批量模拟单基因或双基因敲除，筛选候选改造位点
- 比较不同碳源或培养基组成对生长和产物生成的影响
- 预测哪些反应在提高产物通量时必须增强，排出过表达候选
- 检查设计中的代谢途径在宿主网络里是否能跑通、前体和辅因子是否够
不适合的情况
- 想得到真实的绝对通量值：FBA 是约束下的最优解，实测通量要靠同位素标记实验
- 需要预测浓度随时间变化或瞬态响应：稳态假设不成立，应考虑动力学模型
- 调控层面的问题，例如某基因为何不表达：常规 FBA 不含转录调控信息
需要准备的数据
- 基因组尺度代谢模型
- SBML 等标准格式的模型文件，含反应、化学计量、基因与反应的对应规则和交换反应；注明物种、模型版本与来源
- 培养基与底物约束
- 可利用的碳源、氮源、无机盐和是否供氧，换算为对应交换反应的通量上下界，注意吸收方向的符号约定
- 实测速率数据
- 底物吸收速率、生长速率和主要副产物分泌速率，单位统一到每克干重每小时，用于校准模型
- 目标产物定义
- 目标代谢物对应的反应或需要新增的分泌反应，以及产物的化学计量式和分子量
分析步骤
- 1
检查模型基本质量
逐项检查质量守恒和电荷守恒是否成立、有多少反应在任何条件下都不能有通量、是否存在不消耗底物就能产生能量或物质的循环。这类问题会让产率预测虚高。发现不守恒的反应先修正化学计量式，存在凭空产能循环时要在计算中限制相关的可逆反应。
- 2
设定培养基约束
把实验培养基翻译成交换反应的边界：能利用的组分开放吸收，不在培养基里的组分把吸收上界关掉，厌氧条件把氧交换关闭。碳源吸收速率按实测值设定，这是整个计算的标尺，设错了所有通量都按比例错。设完后列出所有开放的交换反应逐一核对。
- 3
校准并验证模型
在设定好的条件下以生物量反应为目标做一次计算，把预测生长速率与实测值比较，再看主要副产物的分泌是否与实测定性一致。偏差大时先检查碳源吸收速率、供氧设定和非生长相关的维持能消耗。这一步通不过就不要进入改造预测，否则结论不可信。
- 4
确定目标函数
研究生长和代谢分布时用生物量反应作目标；估算理论产率时用目标产物的分泌反应作目标。注意以产物为唯一目标时模型往往给出不生长的解，没有实际意义，常用做法是先固定一个最低生长速率，再在此约束下最大化产物。把两种设定的结果都算出来形成区间。
- 5
考察解的不唯一性
同一最优目标值常对应许多组通量分布。用通量变异性分析算出每个反应在保持最优目标时的可行区间，区间很宽的反应说明其通量没被数据确定，不能据此下结论；再用使总通量最小的求解方式得到一组较为集中的参考分布。只报告单次求解的通量值是常见错误。
- 6
模拟敲除与改造
按基因与反应的对应规则逐个或两两关闭基因，记录生长速率和产物通量的变化，筛出生长影响可接受而产物提升明显的组合。再做扫描式分析：逐步提高产物通量，看哪些反应的通量被迫同向上升，这些是过表达候选；哪些被迫下降，是弱化候选。
关键参数与决策
底物吸收速率上界
这是整个计算的量纲基准。按实测底物消耗速率换算到每克干重每小时并设为吸收上界，所有预测通量和产率都相对这个值成比例。没有实测值时可先算相对结果，但不要把绝对预测值当结论。注意多数求解器中吸收方向用负值表示。
目标函数
最影响结论的选择。生物量目标适合预测野生型行为和敲除后的生长；产物目标给出理论上限但常伴随零生长。实用做法是设定最低生长速率约束后最大化产物，并把生长与产物的权衡曲线整条算出来，用曲线而不是单点来讨论改造空间。
氧气与氧化还原约束
供氧条件通过氧交换反应的边界体现，开放、限制和关闭三种设定会给出完全不同的发酵副产物谱。做微氧条件时氧吸收上界本身就是一个要扫描的参数。设定要与实际培养的通气和搅拌条件对应，否则副产物预测与实验完全不符。
维持能消耗
模型中通常有一个代表非生长相关维持能的反应。这个值偏低会高估生长和产率，偏高会低估。模型发布时一般给了默认值，改变培养条件后可以通过拟合不同底物吸收速率下的生长速率来重新估计，调整时要记录并在结果中说明。
反应可逆性与通路边界
可逆性设定决定了网络中哪些循环可以成立，设置过松会出现热力学上不合理的内部循环，使产率虚高。常见做法是对已知生理上单向的反应强制方向，并在求解时排除不消耗底物的内部循环。改动过的反应要列清单。
常见错误
- 直接用自动重建的草稿模型做产率预测：草稿模型常有不守恒反应和凭空产能循环，算出的理论产率可能明显高于化学上限，必须先做质量检查和修正。
- 没有校准就做改造预测：预测生长速率与实测差距很大时，通量分布本身就不对，在此基础上筛出的敲除位点没有参考价值。先对上野生型再谈改造。
- 只报告一次求解得到的通量值：FBA 的最优解通常不唯一，同一目标值下许多反应的通量可以在很宽区间内变化，不做变异性分析就把单个数值当结论会误导下游实验。
- 混淆吸收方向的符号：交换反应的通量符号约定容易弄错，把吸收写成分泌会让模型凭空获得底物，生长和产率预测全部失真，设完约束要逐条打印核对。
- 以产物为唯一目标得到零生长的解还继续解读：这类解在工程上无法实现，必须加最低生长约束，并把生长与产物的权衡关系一起呈现。
结果怎么看
最优目标值与关键通量表
列出目标函数值、底物吸收速率、生长速率和主要分泌产物通量。先核对碳平衡：进入的碳应能在生物量和分泌产物中找到对应。碳对不上说明有不守恒反应或凭空产生物质的循环，要回到模型检查。
通量变异性区间
每个反应在保持最优目标时的通量上下界。区间窄说明该反应的通量被约束确定，可以作为结论；区间横跨零说明方向都不确定，不能用来支撑改造决策。大量反应区间很宽通常意味着约束太少，需要补充实测分泌速率。
生长与产物权衡曲线
横轴生长速率、纵轴产物通量的可行边界。曲线左上端是理论最大产率对应的零生长点，实用改造目标应落在曲线中段。曲线几乎贴着坐标轴说明该宿主在当前培养基下产物与生长强竞争，需要换底物或补充前体。
敲除模拟结果表
每个基因或组合一行，列出敲除后的生长速率和产物通量。要找的是生长下降有限而产物明显上升的条目。如果大量敲除都显示生长完全为零，检查模型是否缺少同工酶和旁路；如果所有敲除都几乎无影响，说明网络中冗余路径过多，预测区分度不足。
和相近方法怎么选
FBA 与同位素标记代谢流分析
FBA 只用化学计量和边界约束，不需标记实验，能覆盖基因组尺度，但解不唯一且依赖目标函数假设。同位素标记代谢流分析用标记模式反推实际通量，结果带置信区间，但通常只能解析中心代谢的有限网络，实验成本高。设计筛选阶段用 FBA，要定量真实通量时用标记实验。
FBA 与动力学模型
FBA 假设稳态、不含速率常数，因此可以做大网络但只给稳态通量，无法描述浓度变化和瞬态响应。动力学模型含酶动力学参数，能模拟时间进程和调控响应，但参数数量随网络增大而爆炸、难以全部获得，实际只能用于小规模通路。问时间进程选动力学，问稳态分配和理论上限选 FBA。
公开整理模型与自动重建模型
公开发布的同物种模型经过人工整理和实验验证，守恒性和生长表型通常可靠，适合直接用于预测。自动重建适用于没有现成模型的物种，速度快但缺口多、常含不守恒反应，必须补齐缺口并做质量检查后才能用。有现成模型就不要自己重建，重建只作为无可选时的起点。
常见问题
FBA 预测的通量能当成真实通量用吗
不能直接当实测值。FBA 求的是在给定约束和目标函数下的一组可行最优解，同一目标值往往对应许多组通量分布，而真实细胞不一定按你设定的目标运行。合理用法是把它当作可行范围和趋势的判断工具：做通量变异性分析给出区间，用区间和方向支撑结论。要定量真实通量需要同位素标记实验。
目标函数选生物量还是目标产物
看问题。预测野生型生长、解释敲除表型，用生物量；估算理论最大产率，用产物分泌反应。但以产物为唯一目标常得到零生长的解，工程上无意义。实用做法是固定一个最低生长速率后最大化产物，并在多个生长水平下重复，画出生长与产物的权衡曲线，用曲线讨论改造空间。
预测生长速率和实测差很多怎么办
按影响大小依次排查：底物吸收速率是否按实测设定且单位正确、吸收方向符号是否弄反、供氧条件是否与实际一致、培养基中不该开放的交换反应是否误开、维持能取值是否合适。再检查模型本身有无不守恒反应或凭空产能循环。野生型对不上之前，不要做改造预测。
怎么从 FBA 结果里找改造位点
两类分析配合。一是批量敲除模拟，逐个或两两关闭基因，筛出生长影响可接受而产物上升的组合，这些是敲除或弱化候选。二是扫描式分析，逐步抬高产物通量，看哪些反应的通量被迫同向增加，这些是过表达候选。两类结果取交集和互补，再按实验可行性排序，最后必须在菌株中验证。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 的生信模式里给出物种、培养基和目标产物，它会确认分析方案，载入基因组尺度代谢模型并做守恒性与阻断反应检查，把培养基翻译成交换反应边界，先用生物量目标校准野生型生长，再计算理论产率、生长与产物的权衡曲线、通量变异性区间，并批量模拟基因敲除和扫描过表达候选，交付通量分布图、敲除结果表、结果说明和可复现的分析脚本。
我想用大肠杆菌以葡萄糖为碳源产琥珀酸，帮我用基因组尺度模型算理论产率并筛出值得敲除的基因