生物合成基因簇挖掘（antiSMASH）
微生物的抗生素、铁载体和色素等分子，大多由成簇排列的基因共同合成，称为生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster，BGC）。一个典型的 BGC 包含合成骨架的核心酶（如 NRPS、PKS、萜类合酶）、修饰酶、转运和调控基因。BGC 挖掘就是在基因组中定位这些簇、判断其化学骨架类型、与已知产物的簇有多像，用来筛选值得分离鉴定的新天然产物。最常用的工具 antiSMASH 用核心酶的隐马尔可夫模型加规则组合识别簇，输入可以是单菌组装、宏基因组 contig 或 MAG。
什么时候用
- 新分离的放线菌、芽孢杆菌或真菌测序后，评估其次级代谢潜力
- 比较同一属多个菌株的 BGC 组成，寻找菌株特有的簇
- 从土壤、海洋或肠道宏基因组 MAG 中筛选新型天然产物线索
- 已知某菌产生活性物质，想定位负责合成它的候选基因簇
- 为基因簇异源表达或敲除实验挑选目标簇和边界
不适合的情况
- 只有 16S 扩增子数据：没有基因组序列，无法识别基因簇
- 把预测的化学结构当作实际产物：核心结构预测只是推测，需要质谱和核磁验证
- 高度碎片化的短 contig 组装：簇被切断在多个 contig 上，类型和完整性判断不可靠
需要准备的数据
- 基因组组装序列
- FASTA 或 GenBank 格式；N50 越高越好，长读长或混合组装能显著减少被截断的簇
- 基因注释（真菌建议提供）
- 细菌可让 antiSMASH 调用 Prodigal 预测基因；真菌基因含内含子，最好提供 GFF3 注释
- 宏基因组 contig 或 MAG
- 建议先过滤过短 contig，并记录每个 contig 所属的 MAG 和物种注释，方便后续按来源汇总
- 物种与分类信息
- 用于选择 --taxon（bacteria 或 fungi）以及解释结果，例如放线菌和黏细菌通常 BGC 数量更多
分析步骤
- 1
检查组装质量
统计 contig 数、N50 和 CheckM 或 BUSCO 完整度。BGC 往往含长重复的模块化基因，短读长组装容易在 NRPS 和 PKS 处断开，组装较差时要预期大量簇落在 contig 边缘。
- 2
运行 antiSMASH
按物种设置 --taxon，细菌无注释时用 --genefinding-tool prodigal，宏基因组片段可用 prodigal-m。建议开启 KnownClusterBlast 等比较模块，完成后确认没有序列因格式问题被跳过。
- 3
整理 region 列表
从输出的 GenBank 或 JSON 中提取每个 region 的位置、类型、长度和是否位于 contig 边缘。一个 region 可能含多个 protocluster，混合型如 NRPS-T1PKS 要整体看待，不要拆开统计。
- 4
与已知簇比对
查看 KnownClusterBlast 给出的 MIBiG 最相似簇及相似度。相似度高且基因排列一致时，多半能合成已知或类似化合物；相似度低的簇才可能是新颖候选，但需排除被截断的情况。
- 5
核心结构域分析
对 NRPS 和 PKS 簇查看模块组成、腺苷化结构域的底物预测、AT 结构域的延伸单元预测和 KR 立体化学预测，据此推断骨架长度和组成，并与已知化合物结构比较。
- 6
基因簇家族聚类
多个基因组或样本的结果合并后，用 BiG-SCAPE 计算簇间相似度，构建相似性网络并划分基因簇家族（GCF）。与 MIBiG 参考簇聚在同一家族的通常是已知产物，独立成团的家族更值得关注。
- 7
筛选与验证计划
综合完整性、新颖性、物种来源和表达条件排出优先级，确定簇边界，为异源表达、启动子替换或基因敲除设计实验，再结合代谢组数据寻找对应的质谱特征。
关键参数与决策
--taxon 与基因预测
细菌和真菌使用不同的检测规则。真菌若不提供注释、只靠自动预测，内含子会导致基因结构错误，核心酶结构域可能被拆碎，从而漏检或误判簇类型。
检测严格度
由 --hmmdetection-strictness 控制，可选 strict、relaxed、loose，默认 relaxed。loose 更灵敏但低置信度簇更多，大规模筛选时建议按严格度和类型分开汇总。
最小 contig 长度
宏基因组中很短的 contig 几乎不可能包含完整的 BGC，却会显著增加运行时间。常见做法是只分析数千 bp 以上的 contig，阈值应结合组装 N50 决定并在方法中说明。
BiG-SCAPE 距离阈值
相似度距离阈值决定家族划分的粗细。阈值小则家族拆得细、同一化合物的变体可能被分开；阈值大则不同产物被合并。常见做法是比较几个阈值下已知 MIBiG 簇的归类是否合理。
常见错误
- 把 contig 边缘的簇当作完整簇：截断的簇缺少部分模块，KnownClusterBlast 相似度会偏低，容易被误认为新颖簇。
- 直接比较不同组装质量样本的 BGC 数量：碎片化组装会把一个簇拆成多个 region，数量被高估，类型分布也会失真。
- 把 KnownClusterBlast 相似度当作序列一致性：它反映已知簇中有多少基因在查询区域有同源匹配，低相似度也可能只是缺几个修饰基因。
- 忽略 region 边界的扩展：antiSMASH 会在核心基因两侧按规则扩展一段区域，region 中常包含无关基因，设计敲除或克隆前要人工确认边界。
- 只按核心酶类型推断产物活性：同为 NRPS 的簇可以产生结构和活性完全不同的化合物，活性需要实验确定。
结果怎么看
region 汇总表
每行一个 region，列出所在 contig、坐标、类型、长度和是否在 contig 边缘。重点看非边缘的完整簇；如果大多数 region 都在边缘，说明组装需要改进，数量和类型统计应谨慎解读。
基因簇结构图
按箭头展示簇内基因的方向和功能类别，核心生物合成基因、附加合成基因、转运和调控基因用不同颜色区分。核心基因缺失或被截断、簇两端紧贴序列末端时，提示簇不完整。
已知簇比对结果
列出 MIBiG 中最相似的参考簇、对应化合物和相似度，并给出基因排列对比图。基因顺序和组成高度一致说明产物可能相同；只共享少数基因时只能说明有部分相似的合成步骤。
基因簇家族网络
节点是 BGC，边表示相似度超过阈值，颜色可按类型或样本来源区分。包含 MIBiG 参考节点的家族多为已知产物；只出现在特定菌株或生境中的独立家族是筛选新化合物的重点。
和相近方法怎么选
antiSMASH 与 GECCO、DeepBGC
antiSMASH 依赖已知核心酶模型和规则，结果可解释、对已知类型准确，但不易发现没有已知核心酶的新类型。GECCO、DeepBGC 等机器学习方法按蛋白结构域序列预测，可能找出新类型，也会带来更多假阳性，常作为补充。
BGC 挖掘与耐药基因检测
两者都在基因组或宏基因组中找功能基因，但目标不同：耐药基因检测比对 CARD 等耐药数据库，关注单个基因的耐药表型；BGC 挖掘关注成簇的合成通路。抗生素合成簇中常带有自身抗性基因，两种结果可以互相印证。
BiG-SCAPE 与 BiG-SLiCE
BiG-SCAPE 计算簇间两两距离，适合几十到几千个基因组规模的比较，家族划分较精细。BiG-SLiCE 用特征向量快速聚类，适合大规模数据库级分析，但粒度较粗。中小规模研究通常用 BiG-SCAPE 即可。
常见问题
antiSMASH 结果中的 region、protocluster 和 candidate cluster 有什么区别？
protocluster 是按单一检测规则识别的核心区域加两侧扩展；candidate cluster 是相互重叠或相邻的 protocluster 组合，代表可能协同合成的混合型簇；region 是最外层输出单位。统计和报告通常以 region 为单位。
KnownClusterBlast 相似度 100% 就一定是同一个化合物吗？
不一定。100% 表示已知簇的所有基因都在查询区域找到了同源基因，但同源程度、点突变和调控差异都可能使产物结构不同或不表达。它说明合成同类化合物的可能性高，最终仍需代谢产物检测确认。
宏基因组能做 BGC 挖掘吗？
可以，但受组装质量影响很大。短读长宏基因组组装中 NRPS 和 PKS 簇经常被打断，建议优先使用长读长或混合组装，或对分箱得到的高质量 MAG 运行 antiSMASH，并在汇总时单独标注位于 contig 边缘的簇。
真菌基因组跑 antiSMASH 需要注意什么？
真菌基因有内含子，自动基因预测容易出错，建议先用 Funannotate、BRAKER 等流程完成注释，再把 GFF3 和基因组一起提供给 antiSMASH，并设置 --taxon fungi。注释质量直接决定结构域识别是否完整。
怎么判断一个 BGC 是否新颖？
常用几条证据叠加：KnownClusterBlast 相似度低、在 BiG-SCAPE 网络中不与 MIBiG 参考簇聚在一起、簇本身完整而不在 contig 边缘、核心结构域组合少见。满足这些条件的簇才适合作为新化合物候选进入实验验证。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供细菌、真菌基因组组装或宏基因组 MAG 后，会先确认物种类型、基因预测方式和样本分组，再识别生物合成基因簇，按 NRPS、PKS、萜类、RiPP 等类型分类，标注是否位于 contig 边缘并与已知参考簇比较。交付 BGC 汇总表、分类统计图、基因簇结构图、报告和可复现脚本。
我有 12 株海洋放线菌的基因组组装 FASTA，想找出每株的生物合成基因簇，按类型统计并挑出和已知簇相似度低的候选