基因组注释（基因结构预测与功能注释）
基因组注释是在组装好的序列上标出基因在哪里、长什么样、可能做什么。它分为两部分：结构注释确定重复序列、基因位置、外显子内含子边界、UTR 和非编码 RNA；功能注释把预测出的蛋白与已知数据库比对，赋予基因名称、蛋白结构域、GO 和 KEGG 通路信息。真核生物结构注释通常整合三类证据：从头预测、转录组证据和近缘物种蛋白同源证据；原核生物基因密度高、几乎没有内含子，用专门工具即可快速完成。若同物种或近缘物种已有高质量注释，也可以把已有基因模型投影到新组装上。注释结果以 GFF3 格式和蛋白、CDS 序列交付，是表达分析、比较基因组和功能研究的基础。
什么时候用
- 完成新物种基因组组装，需要得到基因集用于后续研究
- 同一物种组装出新品种或新个体，想把参考注释迁移过来
- 已有注释质量差、基因数异常，需要用新转录组数据重新预测
- 需要给一批预测蛋白补充 GO、KEGG、Pfam 等功能信息
- 细菌、真菌等小基因组，需要快速完成标准化注释
不适合的情况
- 组装 BUSCO 完整度很低、高度碎片化：基因被截断，注释结果会大量残缺
- 仅凭从头预测、不加任何转录组或蛋白证据就作为最终基因集
- 用投影注释替代远缘物种的独立注释：物种特有基因和结构差异会被遗漏
需要准备的数据
- 基因组组装
- FASTA，建议已去污染和去冗余；序列名尽量简短无特殊字符，部分注释工具对此敏感。
- 转录组证据
- 同物种 RNA-seq 短读长或 Iso-Seq 等全长转录本，覆盖多个组织效果更好，用于确定外显子边界和 UTR。
- 同源蛋白
- 近缘物种的蛋白序列或 OrthoDB 等数据库子集，用于在缺乏表达的基因上提供结构证据。
- 已有参考注释
- 做跨物种或跨版本投影时提供参考基因组 FASTA 和 GFF3，二者版本必须对应。
分析步骤
- 1
重复序列识别
用 RepeatModeler 构建物种特异重复库，再用 RepeatMasker 注释和屏蔽；植物常用 EDTA 处理转座子。基因预测通常使用软屏蔽（小写）序列，重复比例应与近缘物种处于相近范围。
- 2
整理转录与蛋白证据
RNA-seq 用 HISAT2 或 STAR 比对，可再用 StringTie 组装转录本；近缘蛋白可用 miniprot 等工具比对到基因组。证据比对率过低时先确认物种来源和组装版本。
- 3
基因结构预测
使用 BRAKER3 等流程结合 RNA-seq 与蛋白证据训练 AUGUSTUS、GeneMark 并预测基因，也可用 MAKER 或 EvidenceModeler 整合多来源结果。预测出的基因数应在近缘物种的合理范围内。
- 4
注释投影
已有近缘高质量注释时，用 Liftoff 把参考的基因模型映射到新组装，并检查映射失败或拷贝数变化的基因。投影结果可与从头预测合并，补充遗漏基因。
- 5
非编码 RNA 注释
用 tRNAscan-SE 识别 tRNA，用 Infernal 搭配 Rfam 识别 rRNA、snoRNA 等结构 RNA。非编码 RNA 与蛋白编码基因分开存放，避免混入蛋白集影响下游统计。
- 6
功能注释
将蛋白序列用 DIAMOND 或 BLASTP 比对 Swiss-Prot，用 InterProScan 识别结构域并获得 GO，用 eggNOG-mapper 获得 GO 和 KEGG 信息。有至少一类功能注释的基因占比是常用汇报指标。
- 7
质量评估与整理
用 BUSCO 蛋白模式评估基因集完整度，并与组装 BUSCO 对比；统计基因长度、外显子数、单外显子基因比例。最终整理成规范 GFF3，并用 gffread 等工具提取 CDS 和蛋白序列核对无内部终止密码子。
关键参数与决策
屏蔽方式
软屏蔽把重复区改为小写字母，预测工具会参考但不完全忽略这些区域；硬屏蔽改成 N，会让与重复区重叠的真实基因丢失。多数真核基因预测流程推荐软屏蔽。
证据组合
有同物种多组织 RNA-seq 时以转录证据为主，再加蛋白证据补充；没有转录组时只能依赖蛋白同源和从头预测，基因边界和 UTR 准确性会下降，结果需更谨慎解读。
投影参考的选择
Liftoff 适合同物种不同个体或亲缘很近的物种；物种分化较远时序列相似度下降，映射率和外显子边界准确性都会降低，此时应以本物种证据为主。
功能注释阈值
BLASTP 类比对常设 E 值阈值，如 1e-5，并结合覆盖度过滤；阈值过宽会把仅共享一个结构域的蛋白误标为同名基因。命名时优先采用 Swiss-Prot 等人工审校来源。
基因模型过滤
可剔除无证据支持、编码极短肽段或与转座子蛋白高度相似的模型。MAKER 的 AED 值反映模型与证据的一致性，越接近 0 越好，常用作过滤依据。
常见错误
- 不做重复屏蔽直接预测：转座子编码区被大量预测为基因，基因数虚高，功能注释中出现大量逆转录酶、转座酶。
- 重复屏蔽过度、使用硬屏蔽：位于重复区附近或含重复序列的真实基因被删掉，BUSCO 缺失比例上升。
- RNA-seq 只来自单一组织：组织特异表达的基因缺乏证据，只能靠从头预测，结构准确性明显下降。
- 染色体名称或版本不一致：参考 GFF3 与 FASTA 对不上，投影和证据比对大量失败，问题往往到后期才被发现。
- 把 eggNOG 或 BLAST 最佳匹配直接当作基因功能结论：同源只说明可能的功能，还需要结构域和进化关系支持。
- 注释完成后不检查 CDS 完整性：内部终止密码子或不完整阅读框会在后续 Ka/Ks、进化分析中造成错误。
结果怎么看
重复序列统计表
按 LTR、LINE、DNA 转座子、简单重复等类别列出长度和占比。与近缘物种比例差异巨大时，检查重复库构建是否充分或组装是否塌缩重复区。
基因结构统计
基因数、平均基因长度、外显子数、CDS 长度和单外显子基因比例。单外显子基因比例异常高常提示转座子残留或碎片化预测，需要回头检查屏蔽和证据。
BUSCO 注释完整度
基于蛋白集计算完整、重复、片段和缺失比例，应接近组装层面的 BUSCO。注释 BUSCO 明显低于组装 BUSCO，说明基因存在于序列中但没有被正确预测。
功能注释汇总表
每个基因在 Swiss-Prot、Pfam、GO、KEGG 等数据库的注释结果及覆盖比例。没有任何注释的基因比例过高，可能是物种特异基因，也可能是低质量预测，需要结合表达证据判断。
GFF3 与序列文件
包含基因、mRNA、外显子、CDS 等层级。可在 IGV 中叠加 RNA-seq 覆盖抽查若干基因，外显子边界应与剪接读段吻合。
和相近方法怎么选
从头预测与注释投影
从头预测结合本物种证据，能发现物种特有基因，但流程长、需要转录组；投影直接借用参考注释，速度快、命名一致，但只能找到参考中已有的基因。近缘高质量参考存在时可两者结合，否则以从头预测为主。
BRAKER 与 MAKER
BRAKER 自动利用 RNA-seq 和蛋白证据训练预测模型，配置简单；MAKER 能整合更多证据并给出 AED 质量值，可迭代训练，但配置更复杂。首次注释常用 BRAKER，精细整合时用 MAKER 或 EvidenceModeler。
eggNOG-mapper 与 InterProScan
eggNOG-mapper 依据直系同源群转移功能注释，速度快，可直接给出 GO、KEGG 和基因名；InterProScan 识别结构域和蛋白家族，速度较慢但更能反映蛋白的组成。两者常同时使用，结果互相印证。
常见问题
基因组注释一般预测出多少个基因才算正常？
没有通用数值，取决于物种类群和倍性。最可靠的参照是近缘物种已发表的高质量注释，基因数差异过大时，先排查转座子残留、基因碎片化或冗余单倍型未去除等技术原因。
没有转录组数据可以做注释吗？
可以，用近缘物种蛋白同源证据加从头预测，BRAKER 也支持只用蛋白证据的模式。但外显子边界和 UTR 的准确性会降低，物种特有基因更容易遗漏，有条件时建议补测多组织 RNA-seq。
Liftoff 适合什么情况？
适合把一个高质量参考注释迁移到同物种或亲缘很近的新组装上，例如不同品种、品系或个体的基因组。它基于序列比对映射基因模型，物种距离越远映射成功率越低，远缘情况应使用独立预测。
功能注释中的 GO 和 KEGG 怎么得到？
常用 eggNOG-mapper 根据直系同源群转移 GO 和 KEGG 编号，InterProScan 根据结构域映射 GO，KEGG 编号也可通过 KofamScan 或 KAAS 获得。整理后的基因-GO、基因-KEGG 对照表可直接用于富集分析。
注释结果为什么要做 BUSCO？
组装的 BUSCO 说明保守基因是否存在于序列中，注释的 BUSCO 说明它们是否被正确预测为完整基因模型。两者对比可以区分是组装问题还是注释问题，是评价注释质量最常用的指标之一。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里提供基因组 FASTA 并说明物种和可用的转录组、近缘蛋白证据后，会先确认注释方案，然后完成重复序列识别、基因结构预测和功能注释；有近缘物种高质量注释时，还可把参考基因模型投影到新组装上并汇总映射情况。交付 GFF3、CDS 与蛋白序列、功能注释表、注释统计与完整度评估、分析报告和可复现脚本。
我组装了一个鱼类基因组，有 6 个组织的 RNA-seq，想做基因结构预测和功能注释，输出 GFF3 和 GO、KEGG 注释表