长读长测序分析（Nanopore、HiFi）
长读长测序指 Oxford Nanopore（ONT）和 PacBio 两类平台，单条读段从数千到数十万碱基不等，能跨越重复序列、结构变异断点和完整转录本。Nanopore 测的是 DNA 或 RNA 穿过纳米孔时的电流信号，要先经过碱基识别转成序列，同一份信号还能读出 5mC 等碱基修饰；PacBio HiFi 由同一分子多次环形测序得到高准确率的共识读段。长读长分析的基础环节是碱基识别、读段质控和比对到参考基因组，之后才是结构变异检测、单倍型分型、甲基化定量、全长转录本鉴定或基因组组装。它与短读长分析的工具链差异较大，参数需要按平台和化学版本区分。
什么时候用
- 检测短读长难以发现的大片段插入、倒位、串联重复扩增等结构变异
- 用 Nanopore 原始信号同时获取序列和 5mC 等甲基化信息
- 全长 cDNA 或直接 RNA 测序，鉴定完整异构体和融合转录本
- 为从头组装或单倍型分型准备读段，评估读长和深度是否够用
- 病原体、质粒等小基因组的快速测序与比对分型
- 检查重复区、片段重复区等短读长比对不可靠区域的变异
不适合的情况
- 只关心大批样本的常规 SNP 检测：短读长成本更低，准确率成熟
- 低频体细胞突变检测：长读长单碱基误差背景仍高于短读长，难以区分低比例真实变异
- 直接套用短读长比对器和参数，如 BWA-MEM 默认设置处理长读长
需要准备的数据
- Nanopore 原始信号
- POD5 或旧版 FAST5 文件，需记录流动槽、试剂盒和测序芯片版本，碱基识别模型要与之匹配。
- 长读长序列文件
- FASTQ 或未比对 BAM；HiFi 通常以 BAM 交付，保留碱基修饰标签时应以 BAM 形式传递。
- 参考基因组
- FASTA，与后续注释版本一致；比对前可预先建立 minimap2 索引以节省重复运行时间。
- 实验信息
- DNA 或 RNA、是否扩增、是否多重条形码；决定比对预设、是否拆分样本以及能否做甲基化分析。
分析步骤
- 1
碱基识别
Nanopore 数据用 Dorado 把电流信号转成序列，按需选择 fast、hac 或 sup 精度模型，并可同时调用修饰碱基模型。多重条形码文库在此步或之后拆分样本；拆分后未识别条形码的读段比例过高需要检查建库。
- 2
读段质控
用 NanoPlot、NanoComp 等工具统计读段数、总碱基数、读长 N50 和平均质量分布。读长分布与 DNA 提取片段大小应大致对应，短片段异常富集提示 DNA 降解或建库剪切过度。
- 3
过滤与修剪
按质量和长度过滤过短、低质量读段，必要时去除接头和条形码残留。过滤阈值要结合下游目的设定，组装更看重长读段，变异检测则需要保证足够深度。
- 4
比对到参考
用 minimap2 选对应预设比对：ONT 基因组数据用 map-ont，HiFi 用 map-hifi，cDNA 和直接 RNA 用 splice 相关模式。比对后用 samtools 排序建索引，比对率明显偏低提示参考错配或样本污染。
- 5
比对后质控
统计比对率、覆盖深度和均一性、读段一致性（identity）。HiFi 读段与参考的一致性通常很高，ONT 读段一致性受化学版本和模型影响；一致性远低于同平台预期，要回头检查碱基识别模型。
- 6
下游分析衔接
比对 BAM 可用于 Sniffles2、cuteSV 检测结构变异，Clair3 等工具检测小变异，modkit 汇总甲基化，WhatsHap 做单倍型分型。不同下游工具对 BAM 标签和比对预设有要求，开始前确认兼容。
关键参数与决策
碱基识别模型精度
fast 模型速度快适合实时初筛，hac 在精度和速度间折中，sup 精度最高但需要较强 GPU 和更长时间。变异检测、甲基化和组装通常选 hac 或 sup，模型版本需记录以便复现。
minimap2 预设（-x）
map-ont、map-hifi、map-pb 分别对应不同误差模型；splice 用于剪接比对，直接 RNA 常配合 -uf 等链向参数。预设选错会影响比对敏感度和断点精度，结构变异检测尤其敏感。
长度与质量过滤阈值
过滤短读段能提高组装连续性，但会降低深度。经验上组装可按读长分布丢掉最短的一部分读段；变异检测更宜保留深度，只去掉质量明显低的读段。
是否保留修饰标签
Dorado 调用修饰模型后，甲基化信息记录在 BAM 的 MM、ML 标签中。转成 FASTQ 或使用不保留标签的工具会丢失这些信息，需要做甲基化分析时全流程使用 BAM。
测序深度
群体结构变异筛查常做低到中等深度，单样本组装和分型需要更高深度，这些都依研究目标而定。深度不足时杂合结构变异容易漏检，分型区块也会变短。
常见错误
- 混用不同模型版本识别的数据做比较：错误模式不同会在样本间造成系统性差异，被误认为生物学差异。
- 用短读长比对器处理长读长：比对断开成大量补充比对，结构变异断点和覆盖度都会失真。
- 直接 RNA 数据按 DNA 预设比对：剪接位点无法正确跨越，外显子被错误分割，异构体分析失效。
- 把读长 N50 当作平均读长报告：N50 是按碱基加权的长度指标，通常明显高于平均读长，两者混用会误导读者。
- 在均聚物区域相信 ONT 单碱基 InDel：均聚物长度是 Nanopore 的典型误差来源，需要多读段支持或其他平台验证。
- 导出 FASTQ 后再做甲基化分析：修饰标签已丢失，只能从原始信号重新做碱基识别。
结果怎么看
读长分布图
横轴读长、纵轴读段数或碱基数，通常配合读长 N50 一起看。峰值落在预期片段大小附近为正常；大量读段集中在 1 kb 以下，提示 DNA 断裂或建库片段化过度。
读长-质量散点图
每个点是一条读段的长度和平均质量。正常数据质量集中在一个较窄范围；出现与主群分离的低质量群体，可能来自孔道堵塞、接头二聚体或特定测序时段的异常。
比对统计表
包括比对读段比例、平均深度、覆盖度、读段一致性和补充比对比例。补充比对比例异常高说明存在嵌合读段或大量结构变异，需结合具体区域判断。
测序产出时间曲线
Nanopore 测序过程中累计产出与活跃孔数随时间变化。产出过早趋平，说明孔道快速失活，可能与样本纯度或上样量有关，可指导下一次实验优化。
和相近方法怎么选
Nanopore 与 PacBio HiFi
Nanopore 读长上限高，可做直接 RNA 测序并从信号读取修饰，但准确率依赖化学版本和模型；HiFi 读长通常十几到二十几 kb，单读段准确率高。重组装和小变异常选 HiFi，需要超长读段或直接 RNA 选 Nanopore。
长读长与短读长测序
短读长成本低、准确率高，适合大样本 SNP 检测和表达定量；长读长擅长跨越重复区、结构变异和完整转录本。很多项目采用组合方案，用短读长做大样本筛查，用长读长解决难区域和关键样本。
minimap2 与 pbmm2
minimap2 是长读长通用比对器，支持 ONT、PacBio 和剪接比对；pbmm2 是 PacBio 对 minimap2 的封装，直接读写 PacBio BAM 并保留标签，便于衔接 PacBio 官方流程。ONT 数据用 minimap2 即可。
常见问题
Nanopore 碱基识别用什么软件？
目前官方主推 Dorado，它取代了之前的 Guppy，支持 POD5 输入、GPU 加速、条形码拆分和修饰碱基识别。旧数据如果是 FAST5，可以先转换为 POD5 再识别，用新模型重新识别通常能提高准确率。
长读长数据怎么比对？
最常用的是 minimap2，按数据类型选择预设，例如 ONT 基因组用 map-ont，HiFi 用 map-hifi，转录本用 splice。输出 SAM 后用 samtools 排序并建索引，再接结构变异、小变异或甲基化分析工具。
Nanopore 数据可以做 SNP 检测吗？
可以，使用 Clair3、DeepVariant 等针对长读长训练过模型的工具，在足够深度下对常见 SNP 能达到较好的准确率。均聚物附近的小 InDel 仍是弱项，关键位点建议用 Sanger 或短读长验证。
读长 N50 是什么意思？
把所有读段按长度从长到短排序，累加碱基数达到总碱基数一半时那条读段的长度就是 N50。它反映的是大部分碱基所在读段的长度水平，比平均读长更能说明数据对组装和跨重复区的价值。
HiFi 数据还需要做纠错吗？
一般不需要。HiFi 读段在测序时已经通过多次环形测序得到共识序列，单读段准确率较高，主流组装和变异检测工具都直接使用 HiFi 读段。需要额外纠错的主要是旧版本化学的 Nanopore 数据。
在 Codar 里怎么做
在 Codar 里说明测序平台、数据格式和研究目标后，会先确认方案。若提供 Nanopore 原始信号，先做碱基识别；接着做长读长质控，统计读段数、读长 N50 和质量分布并过滤异常读段；再按平台和数据类型选择预设比对到参考基因组。交付比对后的 BAM 与索引、质控图表与统计表、分析报告和可复现脚本。
我有 3 个人类样本的 Nanopore POD5 数据，想做碱基识别和质控，再比对到 GRCh38，看看读长和覆盖深度够不够做结构变异